袁小凌 劉潔 陳衛(wèi)昌

·短篇論著·

3-MA對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的保護(hù)作用

袁小凌 劉潔 陳衛(wèi)昌

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期就可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，胰腺壞死進(jìn)而并發(fā)多器官功能障礙(MODS)[1-2]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是其中最常見的并發(fā)癥，可迅速惡化演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(ARDS)，成為SAP早期病死的主要原因。自噬在急性胰腺炎中的作用是近年來胰腺炎研究的新領(lǐng)域。然而在哺乳動(dòng)物中關(guān)于自噬發(fā)生的機(jī)制尚不明確，其在急性胰腺炎肺損傷中的作用機(jī)制也不明確。本研究采用大鼠急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)模型觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對(duì)ANP并發(fā)的肺損傷的保護(hù)作用。

一、材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體重200～250 g，購自蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、ANP組、3-MA干預(yù)組，每組18只。采用改良的Aho法[3]制備ANP模型，即以0.1 ml/min的速度向胰膽管內(nèi)逆行注入5%?；悄懰徕c。3-MA組在建模前30 min腹腔注射3-MA 15 mg/kg體重(Sigma公司)。假手術(shù)組開腹翻動(dòng)胰腺后即關(guān)腹。各組分別于術(shù)后3、6、12 h腹主動(dòng)脈抽血，分離血清置-80℃保存，將大鼠處死，留取胰腺、肺組織，40 g/L甲醛固定。

2．血淀粉酶、IL-1β測(cè)定：血淀粉酶采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。血IL-1β采用ELISA方法檢測(cè)，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司，按試劑盒說明書操作。

3．胰腺、肺組織病理學(xué)檢查：取固定的各組胰腺、肺組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片，HE染色，采用盲法由?？漆t(yī)師在光鏡下閱片。

4．胰腺、肺組織Beclin-1檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。兔抗鼠Beclin1抗體購自SANTA CRUZ公司，1∶200稀釋，羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧森生物公司。最后DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性封片，顯微鏡觀察。以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒細(xì)胞為陽性細(xì)胞，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色深度進(jìn)行評(píng)估。陽性細(xì)胞：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色深度：無染色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。兩分值相加為總評(píng)分。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，與假手術(shù)組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．胰腺、肺組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠胰腺、肺組織無明顯變化。ANP組3 h時(shí)胰腺輕度充血水腫，點(diǎn)片狀壞死及少量血性腹水，6 h時(shí)病理改變加重，12 h時(shí)胰腺大片壞死，出現(xiàn)大量皂化斑及血性腹水；鏡下見胰腺腺泡水腫、腺泡結(jié)構(gòu)破壞、消失，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔顯著增寬，腺泡細(xì)胞不同程度變性壞死，周圍出血，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，病變呈進(jìn)行性加重。ANP組大鼠均有不同程度肺水腫，肺表面散在出血點(diǎn)，胸腔少量積水，12 h有局部小片狀紫褐色肺不張；鏡下見肺泡及肺間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞滲出，隨時(shí)間延長(zhǎng)加重，肺泡壁破裂，肺泡塌陷實(shí)變，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。3-MA處理組胰腺、肺組織病理變化較ANP組明顯減輕(圖1)。

圖1假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、3-MA組(c)大鼠術(shù)后12 h的胰腺(上)、肺組織(下)病理學(xué)改變(HE ×400)

2．血淀粉酶、IL-1β水平變化：ANP組血淀粉酶、IL-1β水平隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增高，較假手術(shù)組均顯著升高。3-MA組血淀粉酶在6、12 h，IL-1β在3、6、12 h均較ANP顯著降低，但仍顯著高于假手術(shù)組(表1)。

3．胰腺及肺組織Beclin-1蛋白表達(dá)的變化： 假手術(shù)組胰腺組織僅少量腺泡細(xì)胞表達(dá)Beclin-1，肺組織僅少量肺泡間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Beclin-1。ANP組各時(shí)點(diǎn)胰腺及肺組織Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高(t值分別為10.805、10.009、15.513、9.311、12.124、16.658，P值均<0.01)。3-MA組各時(shí)點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)顯著低于ANP組(t值分別為5.853、6.892、9.390、7.129、8.660、10.805，P值均<0.01)，但仍顯著高于假手術(shù)組(t值分別為2.791、3.468、4.497、1.391、2.673、3.464，P值均<0.05，表2，圖2)。

表1 各組大鼠血淀粉酶、IL-1β水平的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.015

表2 各組大鼠肺、胰腺組織Beclin-1的表達(dá)分值

注：與假手術(shù)組比較，aP值均<0.01；與ANP組比較，bP值均<0.05

圖2假手術(shù)組(a)、ANP組(b)、3-MA組(c)大鼠術(shù)后12 h的胰腺(上)、肺組織(下)Beclin-1蛋白表達(dá)(免疫組化 ×400)

討論自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，主要通過對(duì)長(zhǎng)壽命蛋白以及細(xì)胞器的降解和再利用，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。自噬在急性胰腺炎中作用是近年來胰腺炎研究的新領(lǐng)域。Beclin-1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因[5]，通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)形成復(fù)合物參與自噬體的形成，從而使磷脂肌醇磷酸化，產(chǎn)生PI3P，在自噬前體復(fù)合物的形成及自噬小體膜的來源中發(fā)揮重要作用[6-7]。3-MA是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的抑制劑，自噬體的形成依賴于ClassⅢPI3K，ClassⅢPI3K可磷酸化磷脂酰肌醇(PtdIns)，生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)。PtdIns3P募集胞質(zhì)中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成。因此，3-MA是目前應(yīng)用較成熟的自噬抑制劑。

Takahashi等[8]和Ohmuraya等[9]將小鼠的自噬相關(guān)基因Atg5敲除后，應(yīng)用雨蛙素誘導(dǎo)出急性胰腺炎，結(jié)果Atg5-/-小鼠胰腺腺泡細(xì)胞中自噬減少，胰蛋白酶原激活減少，急性胰腺炎的嚴(yán)重程度大大減輕，提示自噬或者某些相關(guān)蛋白與胰蛋白酶原激活有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺和肺組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯升高，與病理變化、炎癥因子IL-1β的變化一致。3-MA干預(yù)后胰腺和肺組織的Beclin-1蛋白表達(dá)下降，病理改變減輕，同時(shí)血清淀粉酶、炎癥因子IL-1β水平降低，但仍高于假手術(shù)組，提示3-MA可能通過PI3K/Akt途徑抑制自噬，在一定程度上緩解ANP并發(fā)急性肺損傷的嚴(yán)重程度。

雖然自噬激活在一定程度上減輕ANP并發(fā)的肺損傷，但盲目抑制或阻斷自噬可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成不可預(yù)料的損傷。因此，進(jìn)一步深入研究自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及如何調(diào)控自噬，對(duì)改善急性胰腺炎肺損傷的臨床治療效果有非常重要的意義。

[1] 李永渝.重癥急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展.中華外科雜志,2009,47:1478-1480.

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2012-10-23)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.017

215006 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

陳衛(wèi)昌，Email:weichangchen@126.com