金 戈 于洪娟 朱美達(dá) 王俊平 郝 偉

沈陽醫(yī)學(xué)院藥理教研室，遼寧沈陽 110034

丙戊酸鈉是臨床常用的廣譜抗癲癇藥，具有療效高、安全性好、很少影響患者認(rèn)知功能的藥效特點(diǎn)。但丙戊酸鈉的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)個(gè)體差異很大，劑量難以掌握。而當(dāng)其血藥濃度＞100 g/L時(shí)，其毒副作用增加而藥效卻無明顯增強(qiáng)[1]。尤以肝臟損傷最令人關(guān)注。肝毒性主要通過抑制糖異生、抑制β-脂酸氧化、抑制細(xì)胞色素P450等主要作用使肝酶類增加[2-3]。臨床資料表明，服用丙戊酸鈉的患者中15%～30%在服藥后出現(xiàn)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及乳酸脫氫酶等肝酶活性的升高[4-5]。五味子是多年生落葉藤本，屬木蘭科，可做藥用。其主要保肝成分五味子乙素（Schisandrin B，Sch B），是從五味子果仁中提取的有效成分，具有顯著的肝臟保護(hù)作用，是多種保肝降酶中成藥的主要成分[6]。其保肝機(jī)制多認(rèn)為是通過清除自由基、誘導(dǎo)肝細(xì)胞色素P450從而增強(qiáng)肝臟的解毒功能、促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)和糖原合成、改善線粒體抗氧化狀態(tài)，但是確切機(jī)制尚不明確[7-8]。另有研究數(shù)據(jù)顯示五味子具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用，這也是其中醫(yī)臨床用于心悸失眠的現(xiàn)代理論依據(jù)。其對(duì)于改善睡眠具有顯著效果且不產(chǎn)生藥物依賴性[9]，有廣泛的中樞抑制作用，并有安定藥的特點(diǎn)[10]。因此本研究旨在探討五味子醇提取物減輕丙戊酸鈉肝毒性的作用及其機(jī)制，進(jìn)一步探討五味子醇提取物協(xié)同抗癲癇的作用，為臨床癲癇病的治療提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

半自動(dòng)生化儀，型號(hào)：RT1904C。酶標(biāo)定量測(cè)試儀：奧地利特TECAN公司，型號(hào)：F039003。

1.2 藥品及試劑

五味子醇提取物：沈陽醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供；丙戊酸鈉：山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20090221；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化歧化酶（SOD）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠120只，體重25～30 g，健康，雌雄各半，由沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組，模型組，五味子醇提取物低劑量組（五味子低劑量組），五味子醇提取物高劑量組（五味子高劑量組），每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，給藥方式：對(duì)照組給予生理鹽水；模型組給予丙戊酸鈉 80 mg/（kg·d）（造模劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得）；五味子醇提取物低劑量組給予丙戊酸鈉同時(shí)給五味子醇提取物50 mg/（kg·d），五味子醇提取物高劑量組給予丙戊酸鈉同時(shí)給五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；連續(xù)灌胃給藥14 d。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠置于安靜環(huán)境分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，每天稱量體重，觀察動(dòng)物進(jìn)食及活動(dòng)情況。

2.2 血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于給藥后禁食12 h。眼球采血置于帶抗凝劑的EP管中，檢測(cè)ALT、AST指標(biāo)，評(píng)價(jià)五味子醇提取物減輕丙戊酸鈉的肝臟毒性作用。

2.3 ELISA檢測(cè)肝組織中GSH-Px、SOD含量

取各組肝組織100 mg，加入生理鹽水900 μL，機(jī)械勻漿。靜置 10 min后，4℃，3000 r/min，離心15 min后取上清液。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)肝組織中GSH-Px，SOD含量。

2.4 五味子醇提取物的協(xié)同抗癲癇作用

取小鼠80只，雌雄各半原則，隨機(jī)分為模型對(duì)照組，五味子醇提取物組（五味子組），丙戊酸鈉組，丙戊酸鈉聯(lián)合五味子醇提取物組（丙戊酸鈉加五味子組）。按照組別給藥：模型對(duì)照組給予生理鹽水；五味子組給予五味子醇提取物100 mg/（kg·d）；丙戊酸鈉組給予丙成酸鈉 80 mg/（kg·d）；丙戊酸鈉加五味子組給予丙戊酸鈉加五味子醇提取物100 mg/（kg·d），連續(xù)給藥 7 d，于第 7 天經(jīng)腹腔注射氯化鋰（127 mg/kg），24 h 后注射硫酸阿托品（1 mg/kg），30 min 后再注射匹羅卡品（300 mg/kg）。觀察小鼠出現(xiàn)明顯的肢體陣攣、強(qiáng)直及跌倒等癲癇癥狀。按照經(jīng)典的Racine癲癇發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癲癇的行為學(xué)評(píng)價(jià)[11]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 結(jié)果

2.6.1 五味子醇提取物對(duì)肝酶的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組ALT、AST升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，五味子高劑量組ALT、AST降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組白細(xì)胞（WBC）變化不明顯。見表1。

表1 五味子醇提取物處理后各組的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

表1 五味子醇提取物處理后各組的小鼠ALT、AST、WBC含量（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；WBC：白細(xì)胞

組別 只數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） WBC（×109/L）空白對(duì)照組模型組五味子低劑量組五味子高劑量組10 10 10 10 37.40±7.62 77.01±11.38#70.30±11.05 45.60±10.54*132.80±23.02 219.60±49.94#215.70±40.01 154.60±33.46*5.98±0.31 6.00±0.26 5.94±0.21 5.98±0.24

2.6.2 五味子醇提取物對(duì)血清酶的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組SOD、GSH降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，五味子高劑量組SOD、GSH升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 五味子醇提取物作用后各組小鼠肝組織SOD、GSH含量變化（±s）

表2 五味子醇提取物作用后各組小鼠肝組織SOD、GSH含量變化（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；SOD：谷胱甘肽過氧化物酶；GSH：超氧化歧化酶

組別 只數(shù) SOD（U/mL） GSH（g/L）空白對(duì)照組模型組五味子低劑量組五味子高劑量組9999 5.47±1.14 2.63±0.79#2.99±0.71 4.50±1.16*55.97±7.41 32.68±6.85#36.26±6.60 47.53±5.11*

2.6.3 五味子醇提取物協(xié)同抗癲癇作用 結(jié)果顯示，與模型組比較，丙戊酸鈉加五味子組Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)動(dòng)物比例明顯降低（P ＜ 0.05）。 見表3。

表3 丙戊酸鈉與五味子醇提取物的協(xié)同抗癲癇作用[n(%)]

3 討論

丙戊酸鈉作為臨床上以應(yīng)用多年的廣譜抗癲癇藥，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷甚至肝衰竭[11]。其機(jī)制可能是：大量丙戊酸鈉影響肝細(xì)胞正常代謝，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基及自由基樣物質(zhì)，產(chǎn)生過氧反應(yīng)，進(jìn)而造成肝細(xì)胞破壞和肝臟功能障礙[12]。五味子富含多種保肝成分[13]，其主要機(jī)制包括：清除肝臟代謝中產(chǎn)生的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞免受自由基損傷[8]。研究表明五味子對(duì)ALT升高的調(diào)節(jié)有獨(dú)特作用[14]。五味子多糖明顯降低老年大鼠血清丙二醛（MDA）含量，并提高老年大鼠血清SOD、過氧化氫酶（CAT）和GSH-Px活性，提示五味子多糖具有改善體內(nèi)自由基代謝紊亂的作用[15-16]。Leong等[17]發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能明顯激活A(yù)ML12細(xì)胞中ERK1/2及Nrf2，從而激活MAPK通路，最終使谷胱甘肽的表達(dá)增強(qiáng)，阻斷氧化劑促凋亡效果。實(shí)驗(yàn)證明，癲癇發(fā)作時(shí)引起神經(jīng)元異常放電的內(nèi)向電流主要是Ca2+內(nèi)流[17]，當(dāng)Ca2+通道通透性增加時(shí)，Ca2+大量?jī)?nèi)流，引起神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)較長(zhǎng)的去極化反應(yīng)及陣發(fā)性去極化漂移或稱爆發(fā)性放電，誘發(fā)癲癇發(fā)作。有研究報(bào)道五味子乙素可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的同步放電，抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[18]。五味子提取物能明顯減少小鼠活動(dòng)次數(shù)，有明顯鎮(zhèn)靜作用。此外五味子提取物還能增加小鼠睡眠次數(shù)，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間[19]。為五味子的協(xié)同抗癲癇作用提供理論依據(jù)。

為了進(jìn)一步探討五味子減輕丙戊酸鈉引起的肝損傷的作用，本實(shí)驗(yàn)采用五味子乙醇提取物連續(xù)灌胃給藥后檢測(cè)血清及肝組織中相應(yīng)指標(biāo)的方法來驗(yàn)證其保肝作用。結(jié)果表明測(cè)定GSH-Px的含量一定程度上可以評(píng)價(jià)肝臟損傷受到氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷的程度。五味子醇提取物可能通過增加肝組織中GSH-Px及SOD的含量產(chǎn)生抗氧化作用，降低血清中的AST和ALT的含量，而達(dá)到保肝的作用。另外，匹羅卡品造模致癲癇的實(shí)驗(yàn)顯示，丙戊酸鈉加五味子醇提取物組Ⅳ級(jí)以上癲癇發(fā)作的動(dòng)物只數(shù)明顯低于模型對(duì)照組。然而對(duì)五味子作用機(jī)制的全面闡述還有待進(jìn)一步研究。

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