曹陽(yáng)

【摘 要】采用選擇性培養(yǎng)基法，在大豆田采集的土壤中分離出自生固氮菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)特征、分子檢測(cè)。結(jié)果表明：形態(tài)觀察為自生固氮菌，采用特異性引物PCR檢測(cè)，能擴(kuò)增出分子量為1500 bp的特異性條帶。結(jié)合形態(tài)和分子檢測(cè)，鑒定為自生固氮菌Azotobacter。

【關(guān)鍵詞】自生固氮菌；分離；鑒定；分子檢測(cè)

自生固氮菌廣泛生存在土壤中，能在常溫常壓條件下，通過(guò)其體內(nèi)固氮酶的作用，把空氣中的氮固定下來(lái)形成氨，進(jìn)一步變成植物可以利用的氮素，對(duì)增加農(nóng)作物產(chǎn)量起著重要作用。自生固氮菌除固氮促進(jìn)植物生長(zhǎng)外，更重要的是它們能夠產(chǎn)生多種植物激素類物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1]。研究表明自生固氮菌可以有效提高多種糧食作物的產(chǎn)量[2-4]。

大豆在世界上不論是總產(chǎn)量或是國(guó)際貿(mào)易等方面都是重要的糧食作物[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)供需矛盾日益突出，提高大豆產(chǎn)量以滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求已迫在眉睫[6]。研究自生固氮菌的分離及鑒定，并且將傳統(tǒng)的自生固氮菌形態(tài)鑒定方法與分子生物學(xué)相結(jié)合，旨在為進(jìn)一步開展自生固氮菌的研究，提高大豆產(chǎn)量，改善大豆品質(zhì)等奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

（1）供試土壤

隨機(jī)選取15株長(zhǎng)勢(shì)良好的大豆植株，去除表層5cm厚的雜物，采集10～20 cm厚土層土樣約2 000g。將采集的15株大豆植株根際土壤充分混勻，組成1個(gè)混合樣品。

（2）培養(yǎng)基

自生固氮菌培養(yǎng)基：葡萄糖 （或甘露醇）10g、氯化鈉0.2g、磷酸二氫鉀0.2g、CaSO42H2O 0.1g、MgSO4 0.2 g、CaCO3 5 g、蒸餾水1000毫升，自然pH。

（二）自生固氮菌分離

（1）把采集的用于測(cè)定的土樣，用1/100天平稱取10g后加入盛有100ml無(wú)菌水的250ml三角瓶中，在振蕩器上振蕩15min，使土樣均勻分散成土壤懸液。

（2）吸取1 ml土懸液至9 ml稀釋液中，依次按10倍稀釋，稀釋為10-2，10-3，10-43個(gè)梯度，所用的移液器每次吸取土懸液時(shí)，在稀釋液中反復(fù)吸入吹出3～5次，使管壁吸附部分飽和以減少因管壁吸附而造成的誤差，并使懸液進(jìn)一步分散。

（3）混菌法進(jìn)行接種。吸取濃度10-4土懸液1ml于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷卻至45℃的選擇性培養(yǎng)基約20ml，與培養(yǎng)皿中的土懸液充分混勻，重復(fù)5次。待凝固后倒置于26～30℃保溫培養(yǎng)48～72h。

（4）挑取單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純培養(yǎng)物后，置于試管斜面在-20℃冰箱中保藏。

（三）菌落形態(tài)鑒定

選取單個(gè)菌落在選擇性培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，適宜的溫度下（25～28℃）連續(xù)培養(yǎng)3-4d，觀察菌落邊緣、表面質(zhì)地和顏色等形態(tài)變化。

（四）菌株分子鑒定

（1）菌絲體的準(zhǔn)備

采用LB液體培養(yǎng)基，在28℃，150 rmim-1振蕩培養(yǎng)24h，10 000 rmim-1離心收集菌體。

（2）DNA的提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA（天根試劑公司，中國(guó)北京）

1、取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5ml，10，000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清。

2、向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。

3、向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混勻。

4、加入220μL緩沖液GB，振蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5、加220μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7、吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD（使用前請(qǐng)檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8、向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前請(qǐng)檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

9、向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12，000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

10、將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11、將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

（3）DNA樣品的檢測(cè)

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的瓊脂糖凝膠中，在電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120 V 的條件下電泳20 min，用溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察電泳條帶，進(jìn)行拍照。

（4）PCR

以菌體DNA為模板，正向引物P1：（AgA gTT TgA TCC Tgg CTC Ag），反向引物P2：（Aag gAg gTg ATC CAg CCg CA） [7]

PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)總體積50μL，25 mmolL-1 Mg2+，菌體DNA 2μL，2.5mmolL-1 dNTPs 2μL，20 μmolL-1正向引物2μL，20μmolL-1反向引物2μL，10×Ex Taq緩沖液5μL，Taq酶（5 U/μL）0.5μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性6 min；94℃ 1min，58℃ 45S，72℃ 90S，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

（5）測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

將以分離得到的菌染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增，最后進(jìn)行測(cè)序，將該序列送入Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)利用Blast軟件與登錄的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較。采用軟件MEGA 4將其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中親緣關(guān)系最近的已知微生物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

二、結(jié)果與分析

（一）菌種分離與鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用自生固氮菌的選擇性培養(yǎng)基從土壤中分離出的菌，革蘭氏染色見(jiàn)圖1，初步鑒定為自生固氮菌，命名為ZS-1。

（1）形態(tài)分析

通過(guò)分離篩選命名為ZS-1的細(xì)菌，革蘭氏染色呈陰性，卵圓形或圓形。經(jīng)過(guò)三四天的培養(yǎng)，細(xì)胞單獨(dú)存在或成對(duì)的菌體呈“8”字形排列（圖1）。

圖1 菌體形態(tài)（28℃ 3d）

（2）16S rDNA分析結(jié)果

對(duì)細(xì)菌ZS-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的16SrDNA片段電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖中可以看到，菌株獲得了片段長(zhǎng)度約為1500bp的16SrDNA條帶。

圖2 菌株ZS-1非特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2中：泳道1空白對(duì)照 ，泳道2為ZS-1菌株的樣品；泳道M為DNA Mark 5000。

（3）序列的同源性檢索及系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序的結(jié)果序列送入Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)blastn程序與GenBank中核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示ZS-1與Azotobacter屬普遍具有較高的相似性，篩選相似性較高的典型菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用于構(gòu)建細(xì)菌ZS-1系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株名稱、編號(hào)及其在GeneBank中序列登記號(hào)為：Azotobacter chroococcum（EU930421.1）、Azotobacter beijerinckii（AB429527.1）、Azotobacter chroococcum（EF620428.1）、Azotobacter beijerinckii（AB429526.1）、Azotobacter chroococcum （AB175653.1）、Pseudomonas sp. GD6（GU566307.1）、Pseudomonas sp. D22（GU566356.1）、Pseudomonasstutzeri（GQ402828.1）、Azotobacter chroococcum（EF620440.1）、Azotobacter chroococcum（EF620427.1）。ZS-1及相關(guān)菌株基于16S rDNA區(qū)域序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）， ZS-1與Azotobacter chroococcum（EU930421.1）處于同一分支，表明兩者親緣關(guān)系最近，相似性可達(dá)99.80%。該菌株在生長(zhǎng)特點(diǎn)及菌落形態(tài)方面均與固氮菌屬符合，據(jù)此初步鑒定該菌株就是自生固氮菌Azotobacter。

圖3 ZS-1系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（如下圖）

三、討論

東北地區(qū)是我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)，特別是黑龍江省大豆播種面積較大，致使重迎茬等現(xiàn)象不斷加重，造成大豆減產(chǎn)、品質(zhì)下降[8-9]。自生固氮菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)外，提高植物的抗逆性，保證了植物和土壤的生產(chǎn)能力并維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[10]。因此自生固氮菌的這種特性必將應(yīng)用于大豆生產(chǎn)中，具有廣闊的發(fā)展前景。本研究從大豆根際土壤中分離鑒定出自生固氮菌Azotobacter，為今后大豆自生固氮菌群的進(jìn)一步深入研究及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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