黃志兵，許 楊，張淑云，李來生，李燕萍

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌330047)

紅曲是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，在我國一直被認(rèn)為具有藥用和食用雙重功效，不僅是祖國寶貴的科學(xué)文化遺產(chǎn)，而且在世界微生物史上具有重要意義。近年來，隨著對紅曲中生物活性物質(zhì)研究不斷發(fā)展，各國學(xué)者對其進(jìn)行深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)紅曲能產(chǎn)生許多令人矚目的次級代謝產(chǎn)物，如紅曲色素、膽固醇抑制劑、及具有降血壓、抗菌、降血氨、抗腫瘤、降血糖等生理活性成分［1］，使傳統(tǒng)紅曲增添新的內(nèi)涵。一種天然物質(zhì)能同時具有多項生物活性實(shí)屬罕見，因此研究紅曲菌新的代謝產(chǎn)物和開發(fā)紅曲新功能現(xiàn)已成為各國研究熱點(diǎn)之一。紅曲菌最主要代謝產(chǎn)物為紅曲色素，紅曲色素是一類聚酮類物質(zhì)，屬于復(fù)合色素，主要包括紅、橙、黃色素三大類，各大類又分為很多組分。目前，已確定出化學(xué)結(jié)構(gòu)的紅曲色素有6種，其中包括紅曲素(Monascin)和紅曲黃素(Ankanavin)兩種黃色素，紅斑紅曲素(Rubropunctatin)和紅曲玉紅素(Monascorabrin)兩種橙色素、紅斑紅曲胺(Monaseorubramine)和紅曲玉紅胺(Rubropunfamine)兩種紫紅色素，它們均屬Azaphilone類真菌代謝物。近年來，越來越多的紅曲菌新的Azaphilone類代謝產(chǎn)物及其抗癌生物活性被報道［2-5］。然而，有關(guān)紅曲菌Azaphilone類代謝產(chǎn)物與BSA相互作用的報道甚少。前期實(shí)驗(yàn)從紅曲中分離純化出兩種熒光代謝產(chǎn)物，分別命名為monasfluore A(MFA)和 monasfluore B(MFB)［6-7］。采用光譜法研究兩種熒光代謝產(chǎn)物與BSA的相互作用下的熱動力學(xué)參數(shù)和作用力類型等，對進(jìn)一步研究紅曲菌Azaphilone類代謝產(chǎn)物的生物活性機(jī)制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲菌兩種熒光代謝產(chǎn)物MFA和MFB 自制，純度大于95%［6-7］;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;NaH2PO4、Na2HPO4、CH3CH2OH 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

FS F-4500熒光分光光度計 日本日立公司;ULTRASPEC4300紫外分光光度計 美國Pharmacia公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將一定量的BSA和上述兩種紅曲菌熒光代謝產(chǎn)物分別加入到容量瓶(10mL)中，并用含50%乙醇的PBS緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)稀釋。準(zhǔn)確移取一定量的上述溶液于石英熒光池(1cm)中，進(jìn)行熒光光譜掃描。BSA的熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為280nm和343nm，發(fā)射波長掃描范圍400～600nm，狹縫寬度為5nm。紫外-可見吸收的參比液為含50%乙醇的 PBS 緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)，吸收波長掃描范圍為300～450nm。

分別在25、35、45℃溫度條件下，固定BSA濃度為3.03×10-6mol/L，加入一系列濃度的MFA或MFB后的BSA溶液進(jìn)行熒光光譜掃描，記錄熒光強(qiáng)度，計算熒光淬滅常數(shù)，推導(dǎo)熒光淬滅機(jī)理。

圖1 MFA(A)和MFB(B)分別與BSA作用的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of MFA(A)and MFB(B)by BSA at different concentration

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

在含 50%乙醇的 PBS緩沖溶液(pH7.4，0.01mol·L-1)條件下，測定了不同濃度的 BSA對MFA和MFB紫外吸收譜圖的影響，從圖1可看出，隨BSA濃度增大，MFA(A)和MFB(B)的最大吸光度值均增加，但MFB增加值比MFA更明顯，說明MFB較MFA更容易與BSA作用。

2.2 熒光光譜

紅曲菌兩種熒光代謝產(chǎn)物(MFA和MFB)的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為396和460nm［6-7］，對一系列含相同濃度的MFA和MFB與不同濃度BSA溶液混合后，靜置30min，然后分別記錄熒光光譜。由圖2(A)可知，隨加入的BSA溶液濃度增加，MFA的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，可能原因是MFA與BSA之間的作用較弱;從圖2(B)可知，隨加入的BSA溶液濃度增加，MFB的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明MFB與BSA之間發(fā)生了明顯的作用。

圖2 MFA(A)和MFB(B)分別與BSA作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence quenched spectra of MFA(A)and MFB(B)by BSA at different concentration

然后固定BSA溶液的濃度，而改變MFA和MFB溶液的濃度，并進(jìn)行熒光光譜掃描。由圖3可知，隨加入的MFA和MFB溶液濃度增加，BSA的熒光強(qiáng)度不斷降低。這說明了MFA和MFB與BSA之間可能存在使得BSA的熒光降低的相互作用。

2.3 熒光猝滅機(jī)理和作用力類型

熒光猝滅過程可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅［8］。若為動態(tài)猝滅，其作用過程遵循Stern-Volmer方程，F(xiàn)0/F=1+Kqτ0［Cmonas］=1+KSV［Cmonas］ 式(1)［9］

根據(jù)上述方程測定了不同溫度(25、35、45℃)時，加入MFA(圖未給出)或MFB后BSA熒光強(qiáng)度的變化，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作出BSA的Stern-Volmer曲線

表1 在pH7.4條件下MFA和MFB與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parmeters of monasfluoreA and monasfluoreB-BSA interaction at pH7.4

圖3 在25℃(A)，35℃(B)and 45℃(C)下MFB對BSA熒光淬滅光譜和Stern-Volmer(D)線Fig.3 Fluorescence quenched spectra of BSA by MFB at different concentration at 25℃(A)，35℃(B)and 45℃(C)，and Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of BSA by MFB(D)

從圖3(D)可看出，隨溫度升高，直線斜率增大，即KSV增大，表明MFB對BSA的熒光猝滅是由于分子間碰撞而引起的動態(tài)猝滅，主要由于升高溫度使得熒光猝滅劑分子和熒光體有效碰撞增加，擴(kuò)散系數(shù)增大，從而猝滅常數(shù)增大;相反，靜態(tài)猝滅隨著溫度的升高，熒光猝滅劑分子和熒光體組成的復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，故猝滅常數(shù)減?。?0］。

從表1結(jié)果可看出，Kq數(shù)量級在1012～1013，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于擴(kuò)散碰撞過程中的最大Kq值，一般認(rèn)為，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2 ×1010L·mol-1·s-1［11］，從這一點(diǎn)考慮，MFA 和 MFB對BSA的熒光猝滅似乎不應(yīng)為動態(tài)猝滅［12］，但考慮到溶液中離子強(qiáng)度是影響猝滅常數(shù)的重要因素［8，11］之一，本實(shí)驗(yàn)體系為緩沖溶液，故本實(shí)驗(yàn)中Kq的增大可能是由離子強(qiáng)度引起的。

當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變ΔH可以看作一個常數(shù)，熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系如下:

根據(jù)生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律［13］，由表1可知，ΔG＜0，表明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，ΔH＞0和 ΔS＞0［13］，表明MFA和MFB與BSA之間主要是疏水作用力。從MFA和MFB結(jié)構(gòu)可以看出，由于MFB含有辛基側(cè)鏈［6］，疏水性明顯強(qiáng)于含己基側(cè)鏈的MFA，故MFB與BSA之間的疏水作用更明顯。

3 結(jié)論

采用光譜法研究了紅曲菌兩種熒光代謝產(chǎn)物與BSA的相互作用，結(jié)果表明紅曲菌兩種熒光代謝產(chǎn)物(monasfluore A，MFA 和 monasfluore B，MFB)結(jié)合BSA內(nèi)源熒光的猝滅是由于紅曲菌熒光代謝產(chǎn)物與BSA之間形成復(fù)合物，符合動態(tài)猝滅機(jī)理。298、308、318K下，MFA與BSA和MFB與BSA的結(jié)合常數(shù)分別為:3.47 ×1012、6.35 ×1012、7.94 ×1012L·mol-1和6.90 ×1012、1.19 ×1013、1.75 ×1013L·mol-1。紅曲菌兩種熒光代謝產(chǎn)物與BSA之間的作用力為疏水作用力，由于MFB含有更長的辛基側(cè)鏈，具有更強(qiáng)的親脂性，因而與BSA之間的疏水作用力更強(qiáng)。

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