喬榮岑，王生富，2，孫進(jìn)忠，張?jiān)S科，廖永洪，2，白朝勇，2*

(1．普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽(yáng) 471000;2．國(guó)家獸藥工程技術(shù)研究中心生物制品研究所，河南洛陽(yáng) 471000)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是引起豬格拉澤氏病(Glasser’s disease)的病原菌［1］。該病常見(jiàn)于 5 ～8周齡的豬，發(fā)病率一般在50% ～70%，死亡率可達(dá)到10%以上［2］。主要引起豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，急性型可引起敗血癥，在不出現(xiàn)典型的漿膜炎時(shí)就呈現(xiàn)發(fā)紺，皮下水腫和肺水腫，甚至死亡，急性感染后可能留下后遺癥，如公豬跛行［3］。近年來(lái)，副豬嗜血桿菌在我國(guó)各豬場(chǎng)引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道越來(lái)越多，在衛(wèi)生條件和管理水平均較好的豬場(chǎng)該病的發(fā)病率和死亡率也逐漸顯著增多，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失。本研究從2008～2009年河南省發(fā)生豬漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的豬場(chǎng)采集58份病料中分離到2株革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，進(jìn)行了一系列鑒定，并對(duì)分離株進(jìn)行了藥敏分析。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料 2008年3月至2009年10月，從河南省不同地區(qū)發(fā)生豬關(guān)節(jié)炎和漿膜炎的20家豬場(chǎng)共采集病豬肺臟55份、關(guān)節(jié)液3份，共58份病料。

1．1．2 主要試劑 革蘭氏染色液，北京索來(lái)寶公司;微量生化鑒定管和藥敏試紙，杭州天和微生物試劑有限公司;輔酶 NAD，上海生工;dNTP、PCR buffer、rTaq DNA 聚合酶、DNAMarker DL 2000、pMD18－T載體(批號(hào):B6805B)、DNA膠回收試劑盒(批號(hào):1208250006)，寶生物工程(大連)有限公司;胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)，Difco公司;優(yōu)級(jí)胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司。

1．1．3 標(biāo)準(zhǔn)分型血清 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司(批號(hào):0902001)。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病豬肺組織、關(guān)節(jié)液用接種環(huán)接種于含10%血清和1μg/mL NAD的TSA平板上，37℃條件下含5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1．2．2 V因子依賴(lài)試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［4］，將可疑菌落分別接種于含NAD及不含NAD的2種TSA平板上，于37℃培養(yǎng)24 h后觀察TSA平板上是否有菌落長(zhǎng)出。

將含有10%脫脂綿羊血的TSA平板上，劃線接種金黃色葡萄球菌，再垂直于金黃色葡萄球菌劃線接種上述分離純化的可疑菌，在37℃條件下含5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否有“衛(wèi)星現(xiàn)象”和溶血發(fā)生。

1．2．3 生化鑒定 取純培養(yǎng)菌落接種于脲酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微量生化鑒定管，按說(shuō)明書(shū)操作并觀察結(jié)果。

1．2．4 PCR鑒定 參照文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)三條引物，由invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成:

HP1F3:5’－TATCGRGAGATGAAAGAC－3’

HP2F2:5’－GTAATGTCTAAGGACTAG －3’

HPRevx:5’－CCTCGCGGCTTCGTC －3’;特異性擴(kuò)增Hps部分16S rRNA基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1090 bp。

1．2．4．1 基因組DNA的提取 挑取單菌落于含50μL雙蒸水中混勻，水浴煮沸5 min，冰上放置5 min，10000 r/m離心2 min取上清作為模板。

1．2．4．2 16sRNA的 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:10 ×Buffer 2．5 μL，dNTP 2．0 μL，MgCL2 1．5 μL，Taq 0．1 μL，模板 2 μL，引物(上、下游)各0．8 μL，加無(wú)菌水至總體積為25μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后4℃保存。

1．2．4．3 測(cè)序 用DNA柱回收試劑盒將PCR產(chǎn)物割膠回收，將其克隆入pMD－18T載體，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送往invitrogen公司測(cè)序。

1．2．5 血清學(xué)分型 用 KieLetein－Rapp－Gabriedson(KRG)瓊脂擴(kuò)散法［6］進(jìn)行血清分型，其中中間孔加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，周邊孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)菌株熱穩(wěn)定抗原、待檢菌株熱穩(wěn)定抗原和PBS液，熱穩(wěn)定抗原參照文獻(xiàn)［7］制備。

1．2．6 藥敏試驗(yàn) 挑取分離菌株，于含NAD鮮血瓊脂平板或TSA平板均勻劃線，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片平貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI/NCCLS)2006 版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果［8－9］。

1．2．7 Balb/c小鼠致死性試驗(yàn) 將分離菌劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水洗脫并分別稀釋至1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL和1 ×108CFU/mL，每只經(jīng)腹腔注射0．2 mL，每個(gè)分離株每個(gè)稀釋度接種5只Balb/c小鼠，同時(shí)另設(shè)5只經(jīng)腹腔各注射相同量的生理鹽水作對(duì)照。接種后觀察精神狀態(tài)及死亡情況，連續(xù)觀察10 d，剖檢Balb/c小鼠，無(wú)菌取其肺臟、心臟血液分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2．1 組織病料分離培養(yǎng) 采集的病料無(wú)菌條件下接種于含輔酶Ⅰ(NAD)和小牛血清的TSA平板，37℃條件下含5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，有針尖大小，約1～2 mm左右，半透亮，表面光滑的菌落長(zhǎng)出。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，有2株為革蘭氏陰性短小桿菌，有2株為革蘭氏陰性球桿菌。

2．2 純化培養(yǎng) 挑取革蘭氏染色為陰性小桿菌的2株疑似菌落，轉(zhuǎn)接入新的TSA平板上，37℃條件下含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行了純培養(yǎng)，36 h后有單菌落長(zhǎng)出，平板上菌落形態(tài)單一。

2．3 V因子依賴(lài)試驗(yàn)和“衛(wèi)星現(xiàn)象” 2株可疑菌株均在含NAD的TSA平板上生長(zhǎng)，在不含NAD的TSA平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。

將可疑菌株在綿羊鮮血瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌交叉劃線，結(jié)果37℃培養(yǎng)36 h后在金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長(zhǎng)，越靠近葡萄球菌的周?chē)渖L(zhǎng)越好，遠(yuǎn)離葡萄球菌的地方菌落較小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，且無(wú)溶血產(chǎn)生(見(jiàn)圖1、圖2)，因此命名2株菌分別為HeN1株和HeN2株。

圖1 HeN1株 "衛(wèi)星現(xiàn)象"，且無(wú)溶血

圖2 HeN2株"衛(wèi)星現(xiàn)象"，且無(wú)溶血

2．4 生化鑒定結(jié)果 分離菌株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果為脲酶試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性，并發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、核糖和麥芽糖等碳水化合物，符合副豬嗜血桿菌的生化特性(見(jiàn)表1)。

表1 V因子依賴(lài)性和生化鑒定結(jié)果

2．5 PCR 結(jié)果

2．5．1 根據(jù)設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌16sRNA引物進(jìn)行了PCR鑒定，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約為1090 bp的目的條帶，見(jiàn)圖3。

2．5．2 測(cè)序結(jié)果 將測(cè)序的結(jié)果與GenBank上發(fā)表的 M75065進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn) HeN1(測(cè)序號(hào)PT5A)和HeN2(測(cè)序號(hào)PT4A)與M75065的同源性分別為96．2%和96．0%，而與M75066的同源性均達(dá)98．0%，可以確定分離的菌株為副豬嗜血桿菌(同源性見(jiàn)圖4、進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖5)。

圖3 HeN1株和HeN2株的PCR鑒定結(jié)果

2．6 血清學(xué)分型結(jié)果 根據(jù)瓊脂擴(kuò)散血清學(xué)分型結(jié)果表明，HeN1株和HeN2株抗原孔均和副豬嗜血桿菌血清4型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔之間出現(xiàn)沉淀線，其它孔之間均未出現(xiàn)沉淀線，因此 HeN1株和HeN2株均為副豬嗜血桿菌血清4型菌株。

2．7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，兩株分離株都對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻吩、替米考星高敏，對(duì)四環(huán)素、丁胺卡那、恩諾沙星、環(huán)丙沙星中敏，對(duì)甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、鏈霉素、阿莫西林、新霉素均耐藥(表2)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2．8 致病性試驗(yàn)結(jié)果 分離菌株菌液感染的Balb/c小鼠在12 h后出現(xiàn)死亡，在24～72 h內(nèi)呈現(xiàn)死亡高峰，對(duì)照組全部健活(表3)。取死亡Balb/c小鼠的肺臟、心臟血液劃線接種含NAD的TSA培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒定，從發(fā)病死亡的小鼠肺心中再次分離菌株與攻毒菌株一致，均為副豬嗜血桿菌。分離的HeN1株和HeN2株以2×109CFU/只的攻毒劑量可致80% ～100%小鼠死亡，表明分離的菌株對(duì)小鼠有較強(qiáng)的毒力。

表3 不同劑量菌液注射Balb/c小鼠后死亡結(jié)果

2 討論

副豬嗜血桿菌病與豬的鏈球菌病、支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎等臨床上很容易將它們混淆［10］。副豬嗜血桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較苛刻，分離鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)、分離率低等缺點(diǎn)，本文用分離細(xì)菌常用的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特性、染色鏡檢、生化鑒定等方法結(jié)合16S rRNA的PCR檢測(cè)。根據(jù)? ysten A等建立的復(fù)合PCR檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了3條引物，擴(kuò)增到1090 bp左右的片段，該P(yáng)CR方法具有高度的種特異性，能夠?qū)⒏必i嗜血桿菌與吲哚放線桿菌［5］、豬放線桿菌相區(qū)別［11］，在分離培養(yǎng)過(guò)程中結(jié)合16S rRNA的PCR檢測(cè)法，排除了2株革蘭氏陰性球桿菌，大大提高了分離效率。同時(shí)所建立的PCR檢測(cè)方法不僅可從分離培養(yǎng)物中對(duì)進(jìn)行鑒定，而且可以直接對(duì)病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，因此，可以應(yīng)用于臨床診斷中。

我國(guó)的副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查顯示，優(yōu)勢(shì)血清型為血清4型、5型、12型和13型［12］。筆者從58份病料中僅分離到2株副豬嗜血桿菌，經(jīng)血清學(xué)分型均為副豬嗜血桿菌血清4型，與調(diào)查結(jié)果相似，未分離到其它血清型菌株，原因可能是樣品采集地區(qū)主要流行血清4型菌株，也可能是用過(guò)抗生素或者是部分病例死亡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的。由于副豬嗜血桿菌的血清型眾多，血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)［13］，副豬嗜血桿菌又具有明顯的地方特征，而疫苗的使用是預(yù)防副豬嗜血桿菌的最有效的方法之一。其防疫用疫苗在西班牙、日本、澳大利亞、加拿大和美國(guó)應(yīng)用極廣泛［14］。因此本文研究為今后副豬嗜血桿菌的臨床診斷和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌分離株對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻吩、替米考星高度中敏，對(duì)四環(huán)素、丁胺卡那、恩諾沙星、環(huán)丙沙星中敏，對(duì)甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、鏈霉素、阿莫西林、新霉素均耐藥。給豬場(chǎng)在合理使用抗生素時(shí)提供了一定的參考。

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