魏秀麗，高迎春，陳 玲，陸慶泉，張呈軍

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，濟南 250022)

金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，國際上于1966年批準作為預(yù)防藥，1976年在預(yù)防藥的基礎(chǔ)上確認為治療藥［1－2］。國內(nèi)20世紀90年代末曾在獸醫(yī)臨床上用于動物病毒病的預(yù)防和治療［3］。金剛烷胺作為抗病毒藥物應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效的實驗數(shù)據(jù)，用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良的后果，而且影響國家動物疫病防控政策，因此2005年10月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告［4］，同年12月發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》［5］，規(guī)定禁止金剛烷胺等抗病毒獸藥的生產(chǎn)和使用。2012年12月18日央視曝光仍有極少數(shù)不法養(yǎng)殖場在利益的驅(qū)動下違規(guī)使用金剛烷胺，嚴重影響消費者對雞肉食品安全的信任。我國對于動物源性食品中金剛烷胺殘留檢測的相關(guān)報道極少，無國家標準。為檢測雞肉組織中可能殘留的金剛烷胺，保障雞肉產(chǎn)品安全，解除人們對白羽肉雞的恐慌，本實驗室建立了雞肉中金剛烷胺殘留量測定的超高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS/MS)。本方法通過優(yōu)化提取凈化條件，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，提高了分離效果，可以作為定性、定量的確證方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 天平，感量0．01 g;分析天平，感量0．00001 g;Waters Quattro premierXE超高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜儀;離心機。SPE固相萃取小柱 Oasis MAX(3 cc/60 mg)、0．22 μm 的濾膜均為 Waters公司。

1．2 藥品及試劑 金剛烷胺，批號A0309578，含量96%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;馬來酸氯苯那敏，批號R275，含量99．7%，中國食品藥品檢定研究院。濃氨水、異丙醇、三氯乙酸均為分析純;甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純;超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(100mm ×2．1 mm，1．7 μm);流動相A:水溶液(0．1%甲酸);流動相B:甲醇(0．1%甲酸);流速:0．3 mL/min;進樣量:10μL;柱溫:35℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;正離子掃描(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子源溫度:110℃;脫溶劑溫度:320℃;脫溶劑氮氣流速:550 L/h;毛細管電壓:3 kV;測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 兩種藥物的定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

2．3 樣品制備

2．3．1 陰性樣品的制備 取雞肌肉100 g進行勻漿，自制陰性樣品。

2．3．2 標準儲備液的制備 精密稱取金剛烷胺對照品10 mg，加甲醇至100 mL，制成100 ug/mL的溶液，作為外標儲備液，－20℃冰箱保存。精密稱取內(nèi)標馬來酸氯苯那敏10 mg，加50%甲醇至100 mL，制成100 ug/mL的溶液，作為內(nèi)標儲備液，4℃冰箱保存。儲備液用初始比例流動相適量倍比稀釋1000倍，得100 ng/mL的工作液。

2．3．3 標準工作液的制備 取適量標準工作液，用初始比例流動相稀釋，制備成含內(nèi)標20 ng/mL的系列濃度為:1、2、4、10、20 ng/mL 標準工作液，繪制標準曲線。取濃度為4 ng/mL的標準工作液作為UPLC－MS/MS對照品溶液。

2．3．4 陽性添加樣品的制備 取100 ng/mL的金剛烷胺和氯苯那敏工作液各適量加入到自制陰性樣品中配置成的1、2、5、10 ng/g的陽性添加樣品，內(nèi)標均為10 ng/g。

2．4 提取凈化方法

2．4．1 樣品提取 取各種樣品(2±0．05)g置于50 mL離心管內(nèi)，加入0．5%的三氯乙酸∶乙腈(1 ∶1，V/V)10 mL，震蕩 10 min，10000 r/min 離心10min，取上清液待凈化。

2．4．2 SPE流程 固相萃取小柱 Oasis MAX用3 mL甲醇、3 mL水依次活化，把上清液過柱，依次用3 mL 2%甲酸水溶液、3 mL甲醇清洗，擠干，用5%氨化甲醇∶異丙醇(1∶1)洗脫入氮吹管，氮氣吹干，用1 mL 0．1%甲酸:甲醇(9∶1)定容，用濾膜濾過，取濾液作為UPLC－MS/MS供試品溶液。

2．5 方法線性考察及添加回收試驗結(jié)果

2．5．1 標準曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各離子，在1～20 ng/mL的范圍內(nèi)標準曲線方程為Y=0．0892X－0．0345，Y為金剛烷胺定量離子和馬來酸氯苯那敏定量離子峰面積的比值，X(ng/mL)為金剛烷胺的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2為0．997，線性良好。

2．5．2 方法的準確度和精密度 雞肉中添加金剛烷胺以馬來酸氯苯那敏為內(nèi)標物，液質(zhì)分離良好，無任何干擾，檢出限為1 ng/g，定量限2 ng/g;雞肉的添加濃度分別2、5、10 ng/g，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于20%，陽性添加樣品的回收率在85%～125%(表3)。各特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1－圖3。

表3 雞肉中添加金剛烷胺的回收率試驗結(jié)果(n=6)

圖3 2 ng/g陽性添加特征離子質(zhì)量色譜圖

3 討論

3．1 本實驗選擇甲醇(0．1%甲酸)和乙腈(0．1%甲酸)為流動相B作比較，發(fā)現(xiàn)以乙腈為流動相，其特征離子質(zhì)量色譜圖的峰形和分離度不如用甲醇做流動相好，最終選擇了甲醇(0．1%甲酸)為流動相B。

3．2 本實驗參考文獻方法［1－2］選擇了馬來酸氯苯那敏作為金剛烷胺的內(nèi)標物，以內(nèi)標法計算結(jié)果線性良好。因肌肉組織不同于血漿，成分更復(fù)雜，重新研究提取方法和凈化方法，采用三氯乙酸 ∶乙腈(1∶1，V/V)提取試樣中殘留的金剛烷胺，并經(jīng)固相萃取小柱Oasis MAX的凈化濃縮，上機檢測無干擾，分離度和精密度良好。

3．3 本實驗只針對雞肌肉組織中金剛烷胺的殘留檢測進行了方法學(xué)的考察驗證，對雞的其他組織未進行驗證，下一步需要進一步研究雞肝、雞腎中金剛烷胺的殘留檢測方法，為進一步制定國家標準奠定基礎(chǔ)。

本方法建立了UPLC－MS/MS法測定雞肌肉組織中的金剛烷胺殘留，采用內(nèi)標法，對樣品進行提取凈化后測定，準確性靈敏度高、檢測限低。通過方法學(xué)考察，本方法完全適合雞肌肉組織中金剛烷胺殘留的定性、定量檢測。

［1］ 戴曉健，陳笑艷，張 勇，等．液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人血漿中金剛烷胺和氯苯那敏［J］．藥物分析雜志，2006，06:17－21．

［2］ 李云巍，周小淳，秦煥杰．同時測定人血漿中金剛烷胺、馬來酸氯苯那敏的分析方法［J］．中國醫(yī)藥指南，2012，10(26):450－452．

［3］ 云 環(huán)，張朝暉，羅生亮，等．固相萃取/LC－MS－MS法檢測動物源性食品中的金剛烷胺［J］．現(xiàn)代儀器，2009，06:42 －45．

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第560號［Z］．2005．

［5］ 農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］33號關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知［Z］．