周 煒，應永飛，韋敏玨，陸春波，林仙軍，羅成江，張志健，朱聰英

(浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310020)

β－受體激動劑可促進動物肌肉生長并促進脂肪組織的分解代謝，因而統(tǒng)稱“瘦肉精”。從20世紀末供港活豬引發(fā)的瘦肉精中毒事件到雙匯收購“健美豬”事件，瘦肉精引發(fā)的公共事件層出不窮，且有愈演愈烈的趨勢。為配合農業(yè)行政主管部門有效、有力地打擊動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非法使用瘦肉精的行為，檢測機構對飼料、動物可食性組織及動物尿液中β－受體激動劑殘留檢驗的準確性和精確度的要求也日趨增高。

在檢測過程中，受人員、儀器、材料、方法及環(huán)境等諸多因素的影響，測量結果可能出現(xiàn)較大波動，因而對測定結果的評定需要統(tǒng)一的度量尺度，目前國際上推薦使用不確定度來評估分析測試結果的質量。不確定度越小，分析測試結果越可靠，因此，測量不確定度是測量結果質量的定量表征［1］。本文依據(jù)農業(yè)部1063號公告－3－2008《動物尿液中11種β－受體激動劑的檢測液相色譜－串聯(lián)質譜法》［2］測定動物尿液中11種β－受體激動劑，分析檢測過程中不確定度的來源，依據(jù)ISO/IEC17025［3］及中國實驗室國家認可委員會發(fā)布的《化學分析中不確定度的評估指南》［4］的要求，計算各個過程中所產生的不確定度，分析各因素對合成不確定度的貢獻比，為完善實驗操作提供理論依據(jù)以及正確使用檢測數(shù)據(jù)提供參考。

1 材料與方法

1．1 儀器 高效液相色譜儀串聯(lián)質譜儀(Agilent 1290－ AB 5500 Q－Trap，配 ESI離子源);Waters MCX固相萃取小柱(60 mg，3 mL);離心機;氮吹儀;pH計。

1．2 試劑 叔丁基甲醚、叔丁醇、氫氧化鈉、氨水均為分析純;甲醇、甲酸均為色譜純。標準品:鹽酸克倫特羅(中國計量科學研究院，99．1%)、沙丁胺醇(Dr．Ehrenstorfer，95．0%)、鹽酸萊克多巴胺(中國計量科學研究院，95．8%)、齊帕特羅(T．R．C．MC，90．0%)、氯丙那林(Witega，99．7%)、硫酸特布他林(Dr．Ehrenstorfer，99．0%)、西馬特羅(中國計量科學研究院，99．9%)、西布特羅(Witega，99．6%)、馬布特羅(Dr．Ehrenstorfer，99．0%)、鹽酸溴布特羅(Dr．Ehrenstorfer，98．5%)、班 布 特 羅 (Dr．Ehrenstorfer，98．0%)、D9－ 克倫特羅(Dr．Ehrenstorfer，98．4%)、D3－ 沙丁胺醇(Dr．Ehrenstorfer，98．0%)、D3－鹽酸萊克多巴胺(PowerCDN，97．1%)。

1．3 對照溶液及內標溶液配制

1．3．1 對照溶液的配制 分別精密稱取11種β－受體激動劑類藥物對照品10 mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為1 mg/mL標準儲備液。分別吸取11種β－受體激動劑標準儲備液10μL，置同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為1μg/mL標準工作液。

1．3．2 內標溶液的配制 分別精密稱取D9－克倫特羅、D3－沙丁胺醇、D3－鹽酸萊克多巴胺對照品10 mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為1 mg/mL內標儲備液。分別吸取上述三種內標儲備液10μL，置同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為1μg/mL內標工作液。

1．3．3 混標上機液的配制 分別精密量取濃度均為1μg/mL的標準工作液和內標工作液100μL，置同一10mL玻璃管中，收集陰性樣本洗脫液5mL后，同試樣操作，作為100 ng/mL混標上機液。

1．4 測定方法 精密量取5．00 mL動物尿液樣本，置于50 mL離心管中，加入100 ng/mL內標工作液100μL，渦漩混勻，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調 pH至9～10。加入叔丁醇 －叔丁基甲醚(60 ∶40，V ∶V)10 mL，充分振蕩，10000 r/min 離心3 min，將上清液轉入另一50 mL離心管中，重復提取一次，合并上清液，60℃氮吹至干。加入0．2%甲酸水溶液3 mL，超聲使溶解后，渦漩混勻備用。

MCX固相萃取小柱依次用甲醇、水3 mL活化。取提取液過柱，并依次用0．2%甲酸水溶液、甲醇3 mL淋洗，擠干。用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，60℃氮吹至干。精密加入0．2%甲酸水溶液1 mL，超聲使溶解后，渦漩混勻，經(jīng)0．22μm水系微孔濾膜濾過，進樣測定。

1．5 檢測條件

1．5．1 色譜條件 色譜柱:Waters Atlantis dC18柱(3．0 mm×150 mm，粒徑3μm);流動相及流速見表1;柱溫35℃;進樣量5μL。

表1 流動相組成和流速

1．5．2 質譜條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應監(jiān)測;離子源電壓5500 V;輔助加熱氣溫度500℃;氣簾氣流速:40 L/h;脫溶劑流速:中等;離子源氣流速:霧化氣和輔助氣均為45 L/h;駐留時間20 ms;11種β－受體激動劑及3種內標化合物的定性、定量離子對及錐孔電壓等質譜參數(shù)見表2。

表2 11種β-受體激動劑及3種內標化合物的定性、定量離子對及錐孔電壓等質譜參數(shù)

2 結果與討論

2．1 測量不確定度的數(shù)學模型 按公式(1)計算試樣中11種β－受體激動劑藥物殘留量:

上述兩個公式中:Cx為試樣中被測物殘留量(μg/L);Cs為混標上機液中被測物的濃度(μg/L);Ci為試樣中相應內標物的濃度(μg/L);Ax為試樣中被測物的峰面積;Asi為混標上機液中相應內標物的峰面積;V為體積濃縮系數(shù);vs為混標上機液進樣量(μL);Csi為混標上機液中相應內標物的濃度(μg/L);Ai為試樣中相應內標物的峰面積;As為混標上機液中被測物的峰面積;R為回收率;vx為試樣進樣量(μL);V定容為試樣最終定容體積(mL);Vx為試樣取樣體積(mL)。

2．2 測量不確度的來源及合成

(1)混標上機液中被測物濃度的相對標準不確定度urel(Cs);(2)試樣中相應內標物濃度的相對標準不確定度urel(Ci);(3)試樣中被測物峰面積的相對標準不確定度urel(Ax);(4)混標上機液中相應內標物峰面積的相對標準不確定度urel(Asi);(5)濃縮過程的相對標準不確定度urel(V);(6)混標上機液進樣體積的相對標準不確定度urel(vs);(7)混標上機液中相應內標物濃度的相對標準不確定度urel(Csi);(8)試樣中相應內標物峰面積的相對標準不確定度urel(Ai);(9)混標上機液中被測物的峰面積的相對標準不確定度urel(As);(10)回收率的相對標準不確定度urel(R);(11)試樣進樣體積的相對標準不確定度urel(vx)。

2．3 各項不確定度的計算

2．3．1 混標上機液中被測物及相應內標物濃度的不確定度urel(Cs)、urel(Ci)及urel(Csi)(B類不確定度)

2．3．1．1 標準品純度引起的不確定度urel(A)

由供應商(或證書)提供的11種β－受體激動劑類藥物標準品及3種內標物標準品純度及其引起的相對標準不確定度分別為:鹽酸萊克多巴胺:0．02;鹽酸克倫特羅:0．008;沙丁胺醇:0．02;硫酸特布他林:0．005;西馬特羅:0．02;馬布特羅:0．005;氯丙那林:0．001;齊帕特羅:0．005;西布特羅:0．0005;班布特羅:0．005;鹽酸溴布特羅:0．01;D9－克倫特羅:0．005;D3－鹽酸萊克多巴胺:0．005;D3－沙丁胺醇:0．005。

2．3．1．2 標準品稱量引起的不確定度urel(B)

(1)天平稱量變動性:標準偏差0．02mg;

(2)天平最大允許誤差:±0．1mg，p=95%;故u=0．1/1．96=0．0510mg;

2．3．1．3 配制標準儲備液引起的不確定度urel(C)

(1)容量瓶體積:10mLA級容量瓶檢定證書檢定為 ±0．01mL，均勻分布，u =0．01=0．0058mL;

(2)定容至刻度的變動性:重復定容10次的標準偏差為0．015mL;

(3)溫度:一般假設溫度變化為±3℃，溶劑以水為代表，在20℃時膨脹系數(shù)為2．1×10－4·℃－1，則p=95%時體積變化區(qū)間為±10×3×2．1×10－4=0．0063mL，標準偏差為0．0063/1．96=0．0032mL。

2．3．1．4 配制混標上機液引起的不確定度 urel(D)10mL容量瓶u(V10mL)檢定證書給出誤差為:±101．3 μL，均勻分布，u(V10mL)= 0．1013/=0．0585mL;重復定容10次的標準偏差為0．0907 mL;p=95%時體積變化區(qū)間為 ±10×3×2．1×10－4=0．0063mL，標準偏差為 0．0063/1．96=0．0032mL;分量的合成標準不確定度:;相對標準不確定度:0．1080mL/10mL=0．0108。

由1mg/mL稀釋至100ng/mL，稀釋因子為f100－0．1和 f1－0．1;10 ～ 100 μL 移液器 u(V100μL)檢定證書給出誤差為:±1．00μL，100～1000μL移液器u(V1mL)檢定證書給出誤差為:±1．18μL;均采用均勻分布，因此:u(V100μL) =0．001/=0．0006 mL;urel(V100μL)=0．0006/0．1=0．0060;urel(V1mL)=0．0007/1=0．0007;u(V1mL)= 0．0012/=0．0007 mL;

2．3．2 峰面積引起的不確定度urel(Ax)、urel(Asi)、urel(Ai)及urel(As)(B類不確定度) 試樣中被測物峰面積(Ax)、混標上機液中相應內標物的峰面積(Asi)、試樣中相應內標物的峰面積(Ai)和混標上機液中被測物的峰面積(As)引起的不確定度均可歸為峰面積引起的不確定度。利用10ng/mL混標上機液，5次重復進樣，得到14種對照品峰面積，根據(jù)貝塞爾(Bessel)公式計算，得到:

萊克多巴胺 S標)=0．389%;克倫特羅 S標()=0．570%;沙丁胺醇 S標)=0．814%;特布他林 S標()=0．458%;西馬特羅 S標()=0．131%;馬布特羅 S標)=0．345%;氯丙那林S標)=0．823%;齊帕特羅 S標()=0．992%;西布特羅 S標()=0．270%;班布特羅 S標)=0．538%;溴布特羅 S標)=0．666%;D9－克倫特羅 S標()=0．375%;D3－萊克多巴胺 S標)=0．614%;D3－沙丁胺醇 S標()=0．733%。

2．3．3 進樣體積引起的不確定度urel(v)(B類不確定度) 混標上機液進樣體積引起的不確定度urel(vs)及試樣進樣體積引起的不確定度urel(vx)均由定量環(huán)引起，可視為同一值。定量環(huán)體積誤差為:±0．1μL，按均勻分布，則其標準不確定度為:u(v)= 0．1/=0．0577 μL，相對標準不確定度為:urel(v)/v=0．0577/5=0．0115。

2．3．4 濃縮過程引起的不確定度urel(V)(B類不確定度) 吸取供試樣品5．00mL及加入1．00mL 0．2%甲酸水溶液溶解氮吹至干后的凈化物均引入不確定度。1～5mL和100～1000μL移液器檢定證書給出誤差分別為 ±0．02mL和 ±1．18μL，按均勻分布，則:u(V5) =0．02=0．0115mL，urel(V5)=0．0115/5=0．0023;u(V1)= 0．0012/=0．0007mL，urel(V1)=0．0007/1=0．0007;urel(V)==0．0024。

2．3．5 試樣中添加回收率R(平均回收率)的不確定度urel(R)(A類不確定度) 5次樣品添加回收率，相應結果見表3。本研究所用方法對11種β－受體激動劑的添加回收率在77．8% ～112%之間，相對均為穩(wěn)定;但方法回收率對合成不確定度的貢獻率達到10% ～28%(表5)。因而回收率是引起本方法測定時不確定度的重要因素。

表3 試樣添加回收率R的不確定度

2．4 相對標準不確定度、合成標準不確定度 各因子引起的相對標準不確定度及合成標準不確定度見表4，各因子對合成標準不確定的貢獻率見表5。如表5所示:在各影響不確定度的因素中，試驗加標回收率及混標上機液引起相對標準不確定度對合成標準不確定度影響較大。

表4 相對標準不確定度及合成標準不確定度一覽表

表5 各因素對合成不確定的貢獻百分比 %

2．5 擴展不確定度u 95%置信區(qū)間，取包含因子k=2，得到擴展不確定度。萊克多巴胺U95=2×0．045=9．0%;克倫特羅 U95=2 ×0．050=10．0%;沙丁胺醇 U95=2×0．050=10．0%;特布他林 U95=2×0．051=10．2%;西馬特羅 U95=2 ×0．051=10．2%;馬布特羅 U95=2 ×0．043=8．6%;氯丙那林 U95=2 ×0．051=10．2%;齊帕特羅 U95=2 ×0．057=11．4%;西布特羅 U95=2 ×0．036=7．2%;班布特羅U95=2×0．046=9．2%;溴布特羅 U95=2 ×0．051=10．2%。

2．6 不確定度報告 依據(jù)農業(yè)部1063號公告－3－2008《動物尿液中11種β－受體激動劑多殘留LC－MS/MS檢測》，取包含因子k=2時，對動物尿液中11種β－受體激動劑類藥物殘留檢測結果見表6。

表6 動物尿液中11種β-受體激動劑類藥物殘留檢測結果

3 小結

本研究對動物尿液中11種β－受體激動劑類藥物殘留檢測的測量結果不確定度進行評定，找出了其中影響測量結果的重要因素，但在樣品處理過程中大多操作步驟都會引入不確定度，對每個因素一一確認是十分困難的，因此采用回收率對測試過程引入的不確定度進行評定，再進行合成。由此也得出在測量過程中，應嚴格按照操作規(guī)程進行操作，盡量減少誤差，以保證測量結果的準確性和可靠性。

［1］ 王 蓓，張 鑫，顧 欣，等．液相色譜法測定豬雞可食性組織中四環(huán)素類殘留量的不確定評估［J］．中國獸藥雜志，2010，44(11):8－11．

［2］ 農業(yè)部1063號公告－3－2008．動物尿液中11種β－受體激動劑的檢測液相色譜－串聯(lián)質譜法［S］．

［3］ ISOPIEC導則25．校準和檢測實驗室能力的通用要求［Z］．

［4］ 中國實驗室國家認可委員會．化學分析中不確定度的評估指南［M］．北京:中國計量出版社，2002:12．