李宏偉，王鐵山，熊正文，李 偉，黃 勇，胡海霞

近年來(lái)，隨著人們生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變，消化道腫瘤的發(fā)病率逐年增加。CD105是一種內(nèi)皮細(xì)胞增殖標(biāo)志物，在與腫瘤有關(guān)的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，是目前衡量?jī)?nèi)皮增殖狀態(tài)比較準(zhǔn)確的指標(biāo)。Ezrin是影響?zhàn)じ焦δ芎湍[瘤細(xì)胞惡性演進(jìn)過(guò)程中的重要物質(zhì)。Ezrin蛋白和腫瘤新生血管是近來(lái)臨床研究熱點(diǎn)，但其與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前并不清楚。本研究依據(jù)光波/微波(Lightwave/Microwave，LW/MW)輻射熱效應(yīng)的原理，應(yīng)用免疫組化 LW/MW-EnVisionTM法檢測(cè) CD105和Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并對(duì)其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為判斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為和患者預(yù)后提供客觀(guān)參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集解放軍251醫(yī)院病理科2006年12月—2010年12月手術(shù)切除結(jié)直腸癌標(biāo)本100例，術(shù)前均未行放化療。其中男57例，女43例;高/中分化腺癌73例，低分化腺癌27例;腫瘤未及漿膜層36例，浸潤(rùn)漿膜層64例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。并取同期正常黏膜組織30例(遠(yuǎn)離癌組織4 cm以上)、腺瘤組織30例。所有標(biāo)本按照常規(guī)石蠟切片、染色規(guī)范步驟操作。

1.2 試劑與主要儀器 鼠抗人CD105、Ezrin單克隆抗體、DAB顯色液為福州邁新生物有限公司提供(均為即用型);EnVisionTM試劑盒為福州邁新生物有限公司提供。格蘭仕WD900G LW/MW爐。額定輸入功率:MW為1400 W，LW為1050 W;額定微波輸出頻率為2450 MHz;微波輸出功率為900 W，分為微波、光波、光波/微波組合Ⅰ和光波/微波組合Ⅱ4種輸出功能。

1.3 免疫組化染色方法 采用LW/MW-EnVisionTM法，微波輸出功率分為5檔調(diào)節(jié)，光波輸出為單一光波管發(fā)光，采用LW/MW組合Ⅱ方法，參照文獻(xiàn)［1］及試劑說(shuō)明書(shū)操作。步驟如下:①石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，用LW/MW 5檔(輸出功率90 W，下同)，PBS(pH7．4)洗 2 min，2 次;②抗原修復(fù)［2-3］:用微波 －枸櫞酸鈉緩沖液(0．01 mol/L，pH 6．0)做抗原修復(fù)，先用LW/MW 3檔(輸出功率150 W)修復(fù)抗原2 min，再用LW/MW 5檔修復(fù)抗原5 min，2次，待自然冷卻至近室溫時(shí)自來(lái)水洗，PBS洗2 min，2次;③用LW/MW 5檔，在甲醇－過(guò)氧化氫溶液中封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶2 min，PBS洗2 min，2次;④加一抗，LW/MW 5檔5 min，PBS洗2 min，3次;⑤加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min，PBS洗2 min，3次;⑥加生物素化的羊抗兔IgG(1∶300)，37℃、30 min，LW/MW 5 檔 5 min，PBS 洗 2 min，3次;⑦DAB-H2O2顯色10 min;自來(lái)水終止顯色;⑧蘇木素復(fù)染0．5～1 min(用于圖像分析的切片不作蘇木素復(fù)染);⑨常規(guī)脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 CD105陽(yáng)性:CD105陽(yáng)性分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，呈陽(yáng)性的血管多為新生薄壁、管徑小的血管，大的厚壁血管未見(jiàn)CD105的表達(dá)。微血管計(jì)數(shù)方法［2-4］:以CD105為血管標(biāo)記物的微血管計(jì)數(shù)，首先在低倍鏡下(×40)掃描，尋找腫瘤內(nèi)清楚的血管染色，且微血管密度(MVD)最高的區(qū)域(熱點(diǎn))，然后在 ×200倍鏡(×20物鏡和 ×10目鏡，面積為0．739 mm2)下計(jì)數(shù)腫瘤內(nèi)的毛細(xì)血管和小靜脈數(shù)目，腫瘤硬化區(qū)和鄰近正常結(jié)直腸組織內(nèi)的微血管不作計(jì)數(shù)對(duì)象，只作內(nèi)對(duì)照評(píng)價(jià)免疫組化染色。任何呈棕黃色的陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇且與鄰近血管、腫瘤細(xì)胞和其他結(jié)締組織成分清楚分開(kāi)即為一個(gè)能夠計(jì)數(shù)的微血管。肌層較厚及血管管腔面積＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管均不計(jì)數(shù)。因?yàn)橛?jì)數(shù)微血管的方法在觀(guān)察者之間或觀(guān)察者本人存在差異，所以在不同的時(shí)間計(jì)數(shù)3次，選擇2次相同或相近數(shù)目的平均數(shù)。

1.4.2 Ezrin陽(yáng)性判定:Ezrin陽(yáng)性著色在腫瘤細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CD105標(biāo)記的微血管計(jì)數(shù)結(jié)果 CD105表達(dá)于腫瘤組織內(nèi)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈淺棕至深棕色(圖1、2)。100例結(jié)直腸癌標(biāo)本中微血管計(jì)數(shù)為(36．18±8．27)條，結(jié)直腸正常黏膜組織中未見(jiàn)CD105表達(dá)，結(jié)直腸腺瘤組織中微血管計(jì)數(shù)為(27．73±6．13)條，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。CD105標(biāo)記的微血管與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)(P＜0．05)，見(jiàn)表1。

圖1 結(jié)腸低分化腺癌新生及增生的微血管內(nèi)皮CD105陽(yáng)性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖2 直腸腺瘤血管內(nèi)皮CD105陽(yáng)性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖3 結(jié)腸低分化腺癌Ezrin蛋白陽(yáng)性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖4 結(jié)腸絨毛狀腺瘤Ezrin蛋白陽(yáng)性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

2.2 Ezrin蛋白表達(dá) Ezrin蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜和胞漿，呈淺棕至深棕色(圖3、4)。Ezrin蛋白在結(jié)直腸正常黏膜、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組織表達(dá)陽(yáng)性率分別是 23．3%(7/30)、50．0%(15/30)、72．0%(72/100)，三者表達(dá)陽(yáng)性率依次增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。Ezrin蛋白在100例結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0．05);與其性別、年齡、分化程度、TNM分期無(wú)關(guān)(P＞0．05)，見(jiàn)表1。

表1 Ezrin、CD105蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Ezrin與CD105蛋白表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中的關(guān)系 Ezrin蛋白陽(yáng)性表達(dá)的72例結(jié)直腸癌中CD105標(biāo)記的微血管計(jì)數(shù)為(38．21±6．38)條，明顯高于Ezrin蛋白陰性表達(dá)的28例結(jié)直腸癌中CD105標(biāo)記的MVD微血管計(jì)數(shù)為(34．74±8．59)條，兩者存在一定的關(guān)聯(lián)性(r=0．406，P＜0.01)。

3 討論

豐富的血管可向腫瘤提供豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，有利于生長(zhǎng);而腫瘤細(xì)胞侵入血管內(nèi)，易導(dǎo)致在其他部位生長(zhǎng)形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶;腫瘤中新生血管數(shù)量越多，越能夠增加腫瘤的生長(zhǎng)速度且發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性大增。因此，腫瘤組織中血管的定量已被認(rèn)為是一重要的獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［6］。本研究結(jié)果顯示，CD105標(biāo)記的微血管在結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤及結(jié)直腸癌間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，與許多研究結(jié)果相似［7-10］。說(shuō)明微血管在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)過(guò)程中起重要作用，同時(shí)也直接或間接表明抗新生血管治療可抑制腫瘤的生長(zhǎng)［11］。因此，檢測(cè)腫瘤的微血管不僅可以評(píng)估患者的預(yù)后情況，并且可以為臨床制定合理有效的腫瘤治療、控制方案提供理論依據(jù)。

Ezrin蛋白為膜細(xì)胞骨架連接蛋白［12］，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、分化、運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)黏附有重要調(diào)節(jié)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)的相互作用，影響腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［13-14］。有研究發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［15-17］。而最近研究表明，存在持續(xù)活化狀態(tài)Ezrin的細(xì)胞都伴有E-cadherin在細(xì)胞內(nèi)的聚集，導(dǎo)致細(xì)胞連接的破壞，降低細(xì)胞間的黏附，使腫瘤細(xì)胞易于浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸正常黏膜和結(jié)直腸腺瘤，且腺瘤與正常黏膜之間也存在顯著差異，說(shuō)明其可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的促進(jìn)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)Ezrin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與一部分學(xué)者的研究結(jié)果相似［18-19］。Ezrin蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等進(jìn)而參與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［20-22］。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)結(jié)直腸癌中Ezrin蛋白的表達(dá)與CD105標(biāo)記的微血管之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌中CD105標(biāo)記的微血管計(jì)數(shù)明顯高于陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織。提示二者之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，Ezrin蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤微血管的生成，但其機(jī)制尚不十分清楚。有研究認(rèn)為這可能與Ezrin蛋白的高表達(dá)使膜上的轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通過(guò)與Rho蛋白相關(guān)的信號(hào)通路得到放大有關(guān)，后者可通過(guò)蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿越脈管內(nèi)皮向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［23］。

［1］ 熊正文，曲延靜，黃勇，等．光波－微波組合技術(shù)在腸道標(biāo)本石蠟切片與免疫組化染色中的應(yīng)用［J］．華北國(guó)防醫(yī)藥，2006，18(5):312-314．

［2］ Brown R W，Chiralae R．Utility of microwave-citrate retrieval in diagnostic immunohistochomistry［J］．J Mod Pathol，1995，8:515．

［3］ 許良中，楊文濤．免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)［J］．中國(guó)癌癥雜志，1996，6(4):229-231．

［4］ Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al．Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma［J］．J Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875-1887．

［5］ 李榮杰，陶曉峰，賀巖，等．Ezrin、CD44在胃癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性［J］．腫瘤防治研究，2008，35(3):188-190．

［6］ 張江宇，王頎，朱彩霞，等．血管內(nèi)皮標(biāo)記物在乳腺癌演變中的表達(dá)及意義［J］．中華乳腺病雜志:電子版，2007，1(2):25-27．

［7］ 李宏偉，張海，黃勇，等．結(jié)直腸腺癌中CD105的表達(dá)及其臨床病理意義［J］．山西醫(yī)藥雜志，2011(4):344-346．

［8］ 曲長(zhǎng)萍，許宗蘭，王渠源，等．宮頸癌血清CD105的水平及臨床意義［J］．中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2012，6(13):3747-3748．

［9］ Wang X，Hershman D L，Abrams J A，et al．Predictors of survival after hepatic resection among patients with colorectal liver metastasis［J］．Br J Cancer，2007，97(12):1606-1612．

［10］ 鞏有方，姜衛(wèi)星，趙現(xiàn)斌，等．甲狀腺乳頭狀癌組織中CD105的表達(dá)及其臨床意義［J］．中國(guó)醫(yī)藥，2009，4(7):26-28．

［11］ Svagzdys S，Lesauskaite V，PavalkisD，et al．Microvessel density as new prognosticmarker after radiotherapy in rectal cancer［J］．BMC Cancer，2009，26(9):95．

［12］ 劉冀龍．胃癌組織芯片中Ezrin蛋白的表達(dá)及意義［J］．中國(guó)醫(yī)藥，2012，7(12):21-23．

［13］ 許俊龍，張杰，李玉紅，等．早期胃癌組織 Ezrin和CD34表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義的探討［J］．中華腫瘤防治雜志，2011，18(24):1942-1945．

［14］ 高輝，李慶昌．膜細(xì)胞骨架連接蛋白Ezrin與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究現(xiàn)狀［J］．中華腫瘤防治雜志，2009，16(21):1709-1713．

［15］ 孫靜，田軍，吳桂卿，等．Ezrin和Fascin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28(3):339-342．

［16］ 田小林，蔣志慶，羅慶偉．RhoA和Ezrin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］．實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2010，15(1):111-114．

［17］ 潘立峰，吳敏蘭，趙志榮，等．人胃癌組織中 Ezrin、ICAM-1的表達(dá)及意義的研究［J］．中國(guó)綜合臨床，2008，29(7):625-628．

［18］ Zhang Y，Hu M Y，Chen B H，et al．The influence of down regulation of ezrin expression by RNA interference on the growth and metastasis of heptocellular carcinoma:experiment in vitro［J］．Chin Med J，2006，86(8):530-534．

［19］ 張慶飛，楊兵．Ezrin和c-Met在胃癌組織中的表達(dá)及意義［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(4):257-259．

［20］ 陳清勇，嚴(yán)杰，胡慧珍，等．不同轉(zhuǎn)移潛能人肺癌細(xì)胞系Ezrin表達(dá)水平及微絲骨架差異性的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2011，18(13):1013-1016．

［21］ 米洋，岳卓立，李連賀，等．Ezrin和Inos在喉癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究［J］．疑難病雜志，2011，10(3):194-196．

［22］ 李春生．Mta-1與Ezrin在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48(28):4-5．

［23］ Pille J Y，Denoyelle C，Varet J，et al．Anti2RhoA and anti-RhoC siRNAs inhibit the p roliferation and invasiveness of MDA-MB2-31 breast cancer cells in vitro and in vivo［J］．Mol Ther，2005，11(2):267-274．