哈小琴，鄧芝云，董菊子，惠 玲，彭俊華，李曉云，楊志華

糖尿病目前在我國(guó)的發(fā)病率位居第三位，其導(dǎo)致的肢體血管動(dòng)脈缺血和缺血性肌肉損傷發(fā)病率也日益增高，在病理性缺血截肢的病例中51%是糖尿病性下肢缺血性損傷和動(dòng)脈硬化閉塞癥［1］。其發(fā)病機(jī)制主要與高血糖引起的代謝紊亂、血管損傷、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，但微血管病變導(dǎo)致的肌肉纖維缺血、缺氧是最重要的原因之一［2］。研究表明糖尿病神經(jīng)肌肉病變是糖尿病最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生肢體壞疽甚至截肢，后果相當(dāng)嚴(yán)重［3］。當(dāng)前，組織工程及基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，細(xì)胞治療和基因治療的興起對(duì)神經(jīng)肌肉損傷修復(fù)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。而干細(xì)胞由于其具有多向分化潛能備受各國(guó)研究人員的關(guān)注，其中中胚層來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)可跨胚層分化為各類細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞［4］等，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者用于心肌、神經(jīng)修復(fù)等多種疾病的細(xì)胞治療［5-6］，但由于單獨(dú)應(yīng)用MSCs存在如缺血環(huán)境移植細(xì)胞不易存活等缺陷，由此需要探索一條MSCs應(yīng)用的新途徑以提高M(jìn)SCs細(xì)胞治療效果。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一多功能生長(zhǎng)因子，除促進(jìn)血管新生外［7］，對(duì)包括肌肉、神經(jīng)［8］等的器官或組織損傷有一定的修復(fù)作用，但存在其單獨(dú)應(yīng)用修復(fù)保護(hù)作用較弱的缺陷。有研究報(bào)道將HGF和MSCs聯(lián)合應(yīng)用，HGF可以抑制缺血及低營(yíng)養(yǎng)引起的MSCs細(xì)胞凋亡［9］，提高移植存活率，同時(shí)研究結(jié)果也顯示MSCs可以作為HGF基因理想的細(xì)胞表達(dá)載體。因此，本研究采用構(gòu)建的攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓MSCs，以實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肢體缺血為模型，觀察Ad-HGF修飾的骨髓MSCs對(duì)糖尿病大鼠下肢缺血性肌肉損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器 健康成年雄性Wistar大鼠，體重200～220 g，由甘肅省中醫(yī)學(xué)院提供。胰蛋白酶(Gibco公司，美國(guó))，低糖 DMEM(DMEM-LG)培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，Percoll分離液(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國(guó))。高脂、高糖飼料(由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制，配方:基礎(chǔ)飼料67．5%、蛋黃2．5%、蔗糖20．0%、豬油 10．0%);STZ(Sigma 公司，美國(guó));Ad-HGF(攜帶HGF基因的重組腺病毒)、Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因重組腺病毒)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、擴(kuò)增、純化。便攜式血糖儀(雅培公司，美國(guó));酶標(biāo)儀(Labsysems公司，芬蘭);F24500熒光分光光度計(jì)(Hitachi公司，日本);倒置熒光相差顯微鏡(Olympus);光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(Olympus公司，日本)。

1.2 MSCs體外培養(yǎng) Wistar大鼠3只，1%的戊巴比妥鈉麻醉致死，之后用75%乙醇浸泡消毒;無(wú)菌分離股骨、脛骨并剪去兩端，用 PBS沖出骨髓，1600 r/min離心8 min，吸棄脂肪;PBS重懸細(xì)胞;小心加于60%梯度的Percoll工作液之上，1500 r/min離心30 min;吸管小心吸出白色細(xì)胞層，之后PBS重懸細(xì)胞，洗2次，1800 r/min離心8 min;用培養(yǎng)基(10%FBS+DMEM-LG+雙抗)重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶;24～48 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞，之后每3天換液1次。7～10 d后貼壁細(xì)胞長(zhǎng)出明顯的細(xì)胞克隆，用0．25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化，按1×105/25 cm2接種培養(yǎng)瓶，記為第一代。本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞為傳代培養(yǎng)的第3～5代細(xì)胞。

1.3 Ad-HGF轉(zhuǎn)染修飾骨髓MSCs及基因表達(dá)的檢測(cè) 將生長(zhǎng)旺盛的第3～5代骨髓MSCs以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，24 h后棄去培養(yǎng)上清，按照最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)100［10］，加入含Ad-HGF病毒顆粒的于無(wú)血清LG-DMEM培養(yǎng)基，37℃下孵育2 h，吸棄病毒培養(yǎng)基，再加5%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后備用。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)同時(shí)檢測(cè)上清液中HGF表達(dá)水平。

1.4 動(dòng)物模型制備及細(xì)胞治療 取20只健康Wistar大鼠，給予高脂、高糖飼料飼養(yǎng)加小劑量STZ(30 mg/kg)腹腔注射，建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型［11］。選擇血糖水平持續(xù)為21～24 mmol/L時(shí)的大鼠模型16只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日禁食，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，無(wú)菌手術(shù)暴露左側(cè)后肢股動(dòng)脈起始端及其分支，并均以細(xì)手術(shù)線結(jié)扎，造成急性后肢缺血。右側(cè)后肢未做手術(shù)結(jié)扎。并將模型大鼠隨機(jī)分為2組:Ad-HGF修飾的骨髓MSCs治療組(1×106個(gè)/只，A 組)，溶劑對(duì)照組(B組)，每組8只。將A組于手術(shù)后10 min內(nèi)將修飾細(xì)胞一次性分點(diǎn)注射于手術(shù)部位四周，具體是在左大腿肌內(nèi)側(cè)注射3點(diǎn)，左大腿肌外側(cè)注射2點(diǎn)，劑量為0．1 ml/點(diǎn)，B組注射同體積PBS緩沖液。

1.5 組織病理學(xué)觀察 2組均于手術(shù)注射后6周，取結(jié)扎后肢的內(nèi)與外側(cè)肌肉組織標(biāo)本，行常規(guī)組織病理切片染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測(cè) Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓 MSCs后HGF的表達(dá) 將Percol密度梯度分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)4 h后棄去未貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h時(shí)出現(xiàn)紡錘狀貼壁細(xì)胞，在培養(yǎng)10 d左右時(shí)細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，12 d左右達(dá)到細(xì)胞融合時(shí)傳代培養(yǎng)，記為P1代細(xì)胞。第3代骨髓MSCs呈典型的纖維狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形態(tài)較均一。在Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓MSCs后48 h，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中每1×106個(gè)細(xì)胞HGF表達(dá)水平為(96．57 ±5．26)ng/ml。

2.2 大鼠下肢肌肉的組織學(xué)觀察結(jié)果 病理組織學(xué)觀察顯示，B組大鼠下肢肌肉標(biāo)本結(jié)扎側(cè)肌纖維變性、橫紋不清晰;肌纖維及細(xì)胞核變細(xì)、斷裂、染色淡，肌束內(nèi)水腫，以及出現(xiàn)脂肪;A組大鼠下肢肌肉標(biāo)本組織中上述病變不明顯(圖1)。

2.3 大鼠下肢肌束間血管及組織學(xué)觀察結(jié)果 B組大鼠下肢肌束間動(dòng)脈管壁變厚，管腔變小甚至消失，少見(jiàn)新生的小血管，還可見(jiàn)多處肌纖維變性、橫紋不清晰，肌纖維及細(xì)胞核變細(xì)、斷裂、染色淡，肌束內(nèi)水腫。A組大鼠下肢肌束內(nèi)中小動(dòng)脈管壁未見(jiàn)增厚，管壁無(wú)縮小，肌束間可見(jiàn)一些新生小血管(圖2)。

圖1 2型糖尿病模型大鼠下肢肌肉組織學(xué)觀察(HE×100)

圖2 2型糖尿病模型大鼠下肢組織學(xué)觀察(HE×100)

3 討論

糖尿病是一組以血糖水平增高為特征，近年來(lái)發(fā)病率急劇升高的代謝性疾病群。目前全世界約有糖尿病患者2億，據(jù)WHO估計(jì)到2030年這一數(shù)字將達(dá)到3．66億，中國(guó)目前糖尿病患者已超過(guò)4000萬(wàn)，已成為世界第二大糖尿病國(guó)。隨著人口老齡化和肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病患病率將會(huì)日益增加。糖尿病的危害主要在于其慢性并發(fā)癥，其中血管病變是糖尿病慢性并發(fā)癥的基礎(chǔ)病變［12］，也是糖尿病致死的主要原因。

糖尿病肌肉神經(jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率也隨著糖尿病發(fā)病率的急劇增加而逐年上升，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究表明糖尿病肌肉神經(jīng)損害的發(fā)生可能與患者微血管病變、體內(nèi)代謝紊亂等因素密切相關(guān)，是多因素共同作用的結(jié)果［2］。機(jī)體微血管病變發(fā)生后將影響周圍微循環(huán)，使肌肉缺血缺氧，進(jìn)一步引起肌纖維受損［13］。目前雖然治療藥物種類繁多，但尚無(wú)確切有效的治療方法，通常在控制飲食、應(yīng)用降糖藥物的基礎(chǔ)上輔以神經(jīng)系統(tǒng)藥物治療。

當(dāng)前，隨著組織工程和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，細(xì)胞治療和基因治療開(kāi)始應(yīng)用在肌肉神經(jīng)損傷修復(fù)中。而干細(xì)胞具有多向分化潛能，其中中胚層來(lái)源的MSCs，可跨胚層分化為各類細(xì)胞。在國(guó)內(nèi)外已有用于心?。?4］、關(guān)節(jié)缺損［15］、神經(jīng)修復(fù)［16］等多種疾病細(xì)胞治療的報(bào)道。另外MSCs作為基因治療理想的載體細(xì)胞，易分離和培養(yǎng)擴(kuò)增，具有可移植性，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的特點(diǎn)。HGF作為一種多功能生長(zhǎng)因子，除促進(jìn)血管新生外，對(duì)包括肌肉、神經(jīng)等在內(nèi)的器官(組織)損傷有一定的修復(fù)作用。本研究構(gòu)建了攜帶HGF基因的重組腺病毒Ad-HGF，并用其感染修飾骨髓MSCs，將骨髓MSCs作為載體細(xì)胞分泌表達(dá)一定時(shí)間的HGF活性蛋白，使局部移植的Ad-HGF修飾的骨髓MSCs同時(shí)發(fā)揮HGF蛋白的作用和骨髓MSCs的多向分化潛能。

本研究結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠被結(jié)扎的肢體移植了Ad-HGF修飾的骨髓MSCs后，肌肉組織得到了充分的血液供應(yīng)，進(jìn)而肌肉獲得了足夠的氧氣及必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促使其恢復(fù)因缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而造成的結(jié)構(gòu)與功能的損傷。本研究組織病理學(xué)觀察結(jié)果也為此提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)，結(jié)扎股動(dòng)脈后B組患肢肌肉出現(xiàn)肌纖維變細(xì)、斷裂或某些肌束中有缺失肌組織以及脂肪組織浸潤(rùn)的現(xiàn)象，A組肌束中則少見(jiàn)這種現(xiàn)象。提示隨著血運(yùn)的逐漸重建，已發(fā)生變性的肌肉可能得到了逐漸的修復(fù)，肌組織缺失處也會(huì)有新生的肌纖維予以補(bǔ)充。因已有報(bào)道表明，HGF對(duì)能夠形成新生肌纖維的肌衛(wèi)星細(xì)胞有刺激增殖的作用［17］。MSCs也在一定環(huán)境下可分化為肌纖維細(xì)胞而起修復(fù)作用［18］。

［1］ Akbari C M，Macsata R，Smith B M，et al．Overview of the diabetic foot［J］．Semi Vasc Surg，2003，16(1):3-11．

［2］ Cameron N E，Cotter M A．Vascular changes in animal models of diabetic neuropathy［J］．J Neurochem，2003，85(Suppl 2):14．

［3］ 朱憙星．現(xiàn)代糖尿病學(xué)［M］．上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2000:333．

［4］ Mundra V，Gerling I C，Mahato R I．Mesenchymal stem cell-based therapy［J］．Mol Pharm，2013，10(1):77-89．

［5］ Grosheva M，Guntinas-Lichius Q，Arnhold S，et al．Bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation does not improve quality of muscle reinnervation or recovery of motor function after facial nerve transaction in rats［J］．Biol Chem，2008，389(7):873-888．

［6］ Shin L，Peterson D A．Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells［J］．Stem cells Transl Med，2013，2(1):33-42．

［7］ Ha X Q，Ren J P，Bi J J，et al．Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in dog hindlimb ischemia models［J］．Chinese Science Bulletin，2003，48(7):676-680．

［8］ Ha X，Liu B，Qian Z，et al．Hepatocyte growth factor gene transfer effects on the fermal and intramuscular nerve in a canine model of lower limb ischemia［J］．Neural Regen Res，2008，3(6):625-628．

［9］ Forte G，Minieri M，Cossa P，et al．Hepatocyte growth factor affects on mesenchymal stem cells:proliferation，migration，and differentiation［J］．Stem Cells，2006，24(1):23-33．

［10］ 哈小琴，董芳，呂同德．肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因?qū)MSCs的修飾及活性觀察［J］．中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2010，24(5):613-617．

［11］ 張汝學(xué)，賈正平，王娟，等．實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)(Ⅰ)——體重、血糖和肝糖原的變化［J］．西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2007，28(3):161-163．

［12］ Yang W，Lu J．Prevalence of diabetes among men and women in China［J］．N Engl J Med，2010，362(12):1090-1101．

［13］ Uchiyama S，Tsukamoto H，Yoshimura S，et al．Relationship between oxidative stress in muscle tissue and weigh-lifting induced muscle damage［J］．Pflugers Arch，2006，452(1):109-116．

［14］ Ishukane S，Hosoda H，Yamahara K，et al．Allogeneic transplantation of fetal membrane-derived mesenchymal stem cell sheets increases neovascularization and improves cardiac function after myocardial infarction in rats［J］．Transplantation，2013［Epub ahead of print］．

［15］ J Centeno C，D Freeman M．Percutaneous injection of autologous，culture-expanded mesenchymal stem cells into carpometacarpal hand joints:a case series with an untreated comparison group［J］．Wien Med Wochenschr，2013［Epub ahead of print］．

［16］ Wang Y，Xue M，Xuan Y L，et al．Mesenchymal stem cell therapy improves diabetic cardiac autonomic neuropathy and decreases the inducibility of ventricular arrhythmias［J］．Heart Lung and Cir，2013［Epub ahead of print］．

［17］ Sheehan S M，Tatsumi R，Temm-Grove C J，et al．HGF is an autocrine growth factor for skeletal muscle satellite cells in vitro［J］．Muscle Nerve，2000，23(2):239-245．

［18］ Haghighipour N，Heidarian S，Shokrgozar M A，et al．Differential effects of cyclic uniaxial stretch on human mesenchymal stem cell into skeletal muscle cell［J］．Cell Biol Int，2012，36(7):669-675．