王曉輝，羅 蕓，賈慶華，楊霄鵬，王 鯤，哈小琴

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是一種存在于人臍帶華通膠(Wharton＇s jelly，WJ)中的間充質(zhì)干細(xì)胞，其發(fā)育來源于中胚層，形態(tài)和生物學(xué)特性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，可以跨胚層誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、骨骼肌、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)元等多種組織類型細(xì)胞，在組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)等方面具有重要作用［1］，是臨床干細(xì)胞移植治療的理想種子細(xì)胞來源。目前已開展了hUCMSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝臟疾病等多種類型疾病的臨床應(yīng)用研究［2］。hUCMSCs可在多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，向炎癥部位及缺血缺氧部位定向遷移，并且黏附、增殖，與其參與組織再生及損傷修復(fù)功能密切相關(guān)［3］。Notch信號(hào)通路是在上世紀(jì)初期由遺傳學(xué)家Mohr小組在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Notch信號(hào)通路存在于免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)等，參與了調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、存活、遷移以及凋亡等生理及病理過程［4-5］。本研究中應(yīng)用攜帶人Notch1受體胞內(nèi)活性片段(Notch1 intracellular domain，NICD)基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs，激活Notch信號(hào)通路，以期提高h(yuǎn)UCMSCs的增殖、黏附及遷移能力，為hUCMSCs細(xì)胞聯(lián)合Notch1基因移植靶向修復(fù)受損組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 本研究經(jīng)蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，hUCMSCs細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期研究中分離培養(yǎng)。腺病毒 Ad-GFP，滴度為 1．8×1010pfu/ml;Ad-GFP-NICD(Ad-NICD)，滴度為1．6 ×1010pfu/ml為實(shí)驗(yàn)室前期制備、保存。α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國GIBCO公司，培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板、Transwell小室購自美國Corning公司，甲基噻唑基四唑(MTT)購自美國Sigma公司，兔抗人β-Actin單克隆抗體、兔抗人Notch1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，羊抗兔IgG-HRP購自北京中山金橋公司，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液購自武漢博士德公司。

1.2 儀器設(shè)備 AC2-4S1型生物安全柜為新加坡ESCO公司產(chǎn)品，IX-71型活細(xì)胞成像工作站為日本Olympus公司產(chǎn)品，INC153型CO2培養(yǎng)箱為德國美墨爾科技公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，ChemiDoc型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為美國UVP公司產(chǎn)品，DG5033A自動(dòng)酶標(biāo)儀為南京華東電子集團(tuán)公司產(chǎn)品，Mini-PROTEAN蛋白凝膠電泳系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 hUCMSCs的分離培養(yǎng):原代hUCMSCs為實(shí)驗(yàn)室前期工作中，經(jīng)待產(chǎn)婦及其家屬知情同意后，采用組織貼壁培養(yǎng)法從健康新生兒臍帶中分離培養(yǎng)獲得，并且經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定。hUCMSCs加入10 ml含有10%FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每3天進(jìn)行細(xì)胞換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，PBS清洗2遍，消化回收細(xì)胞，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。取第3～5代、對(duì)數(shù)生長期的hUCMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)不同腺病毒轉(zhuǎn)染分為實(shí)驗(yàn)組(Ad-NICD組)、陰性對(duì)照組(Ad-GFP組)、空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染腺病毒組)。

1.3.2 腺病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs:回收消化hUCMSCs，按照細(xì)胞密度5×105個(gè)/孔，接種到6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。更換為無血清的α-MEM培養(yǎng)基，按照MOI=50分別加入腺病毒Ad-NICD及Ad-GFP。培養(yǎng)4 h后，更換為含有10%FBS的 α-MEM 完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和GFP蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)hUCMSCs細(xì)胞增殖的影響:取對(duì)數(shù)生長期的hUCMSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后稀釋細(xì)胞密度為5 ×104個(gè)/ml，按照100 μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入腺病毒Ad-NICD及Ad-GFP轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48、72、96 h 時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基 80 μl/孔，并加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，按照150 μl/孔加入DMSO溶液，微量振蕩器振蕩20 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長490 nm的吸光值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Notch1對(duì)hUCMSCs細(xì)胞周期的影響:當(dāng)hUCMSCs生長融合至80%時(shí)進(jìn)行，消化回收細(xì)胞。消化回收細(xì)胞，離心管中加入1 ml－20℃預(yù)冷的70%乙醇，反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液，4℃固定2 h。PBS洗滌2遍，加入2 ml PI綜合染液(0．005%PI、0．002%RNase A、0．1% 枸櫞酸鈉，w/v)，4℃避光孵育30 min。離心棄去PI染液，加入0．5 ml PBS重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。每組細(xì)胞重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3.5 細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch1對(duì)hUCMSCs黏附能力的影響:當(dāng)hUCMSCs生長融合至80%時(shí)進(jìn)行，消化回收細(xì)胞。消化回收細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞稀釋為密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，按照100 μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，期間每4小時(shí)回收細(xì)胞培養(yǎng)上清，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。按照公式細(xì)胞黏附率(%)=(1－上清細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%，計(jì)算細(xì)胞黏附率，每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3組復(fù)孔。

1.3.6 Transwell小室觀察 Notch1對(duì)hUCMSCs遷移能力的影響:消化回收細(xì)胞，用無血清的α-MEM培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入600 μl的α-MEM完全培養(yǎng)基，放入Transwell小室，37℃孵育30 min。在Transwell小室中加入200 μl的細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室置于4%多聚甲醛中，4℃固定30 min。用棉簽小心擦去上層未遷移細(xì)胞，Giemsa染色5 min，PBS中浸泡清洗除去多余染色液。將微孔膜小心裁切下來，下層膜朝上，滴加PBS封片，鏡下取5個(gè)視野(中央、12、3、6、9 點(diǎn)位置)計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3.7 Western Blot檢測(cè)各組hUCMSCs中Notch1蛋白的表達(dá):消化回收細(xì)胞，加入100 μl RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5;100 mmol/L NaCl;1 mmol/L EDTA;1%TritonX-100;0．1%SDS;0．5 mmol/L DTT;100 mg/L PMSF)，冰浴30 min。蛋白定量后，按照總蛋白 50 μg/孔，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至NC膜。將NC膜置于5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶500稀釋的兔抗人β-Actin單克隆抗體和兔抗人Notch1單克隆抗體4℃孵育過夜。加入1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP抗體，37℃孵育2 h。ECL超敏化學(xué)發(fā)光液顯色，化學(xué)發(fā)光自動(dòng)成像系統(tǒng)拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及GFP蛋白表達(dá)情況 熒光下觀察:腺病毒成功感染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組均出現(xiàn)了GFP蛋白的表達(dá)，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其表達(dá)量增高;空白對(duì)照組未見GFP蛋白的表達(dá)?？梢姽庀掠^察:陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞體積變大，呈長梭形和多邊形，平鋪生長，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，呈漩渦狀，細(xì)胞數(shù)量豐富;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度明顯較快，細(xì)胞形成多個(gè)不完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.2 MTT法檢測(cè)Notch1對(duì)hUCMSCs細(xì)胞增殖的影響 利用MTT法測(cè)量hUCMSCs的OD 490 nm值。實(shí)驗(yàn)組分別與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，OD 490 nm值在培養(yǎng)24 h內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組 OD 490 nm值顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示Notch1基因的表達(dá)能顯著促進(jìn)hUCMSCs的增殖;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUCMSCs細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)組分別與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較，hUCMSCs經(jīng)腺病毒Ad-NICD轉(zhuǎn)染后，隨著Notch1信號(hào)通路的激活，其S期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.05)。說明在實(shí)驗(yàn)組中更多細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，細(xì)胞復(fù)制活躍，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2和圖2。

圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后熒光及可見光下細(xì)胞形態(tài)觀察(×40)

表1 3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞OD 490 nm值(±s)

表1 3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞OD 490 nm值(±s)

注:實(shí)驗(yàn)組為Ad-NICD組，陰性對(duì)照組為Ad-GFP組，空白對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染腺病毒組;與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05;與陰性對(duì)照組比較，cP＜0.05

24 h 48 h 72 h 96 h實(shí)驗(yàn)組 0．157±0．021 0．238±0．018ac0．429±0．031ac0．501±0．023組別ac 0．021陰性對(duì)照組 0．115±0．009 0．170±0．017 0．331±0．026 0．426±0．012空白對(duì)照組 0．132±0．017 0．177±0．011 0．317±0．007 0．380±

2.4 細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch1對(duì)hUCMSCs黏附能力的影響 各組腺病毒感染hUCMSCs，通過流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照公式計(jì)算細(xì)胞黏附率。實(shí)驗(yàn)組分別與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較，在細(xì)胞培養(yǎng)4～8 h，3組細(xì)胞黏附率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);繼續(xù)培養(yǎng)，在12、16、20 h 時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞黏附率高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)＞24 h，3組hUCMSCs大部分細(xì)胞均已貼壁黏附，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞黏附率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明Notch1基因的表達(dá)能顯著增強(qiáng)hUCMSCs的黏附貼壁能力，但當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間大于24 h其促進(jìn)作用不明顯，見表3。

2.5 Transwell小室觀察Notch1對(duì)hUCMSCs遷移能力的影響 利用Transwell小室，測(cè)定hUCMSCs的遷移能力，選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。遷移細(xì)胞數(shù)量實(shí)驗(yàn)組為(69．00±6．73)個(gè)細(xì)胞，空白對(duì)照組為(18．00 ±3．38)個(gè)，陰性對(duì)照組為(17．00 ± 2．69)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明Notch1基因的表達(dá)能顯著增強(qiáng)hUCMSCs的細(xì)胞遷移能力，見圖3、4。

圖2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表2 腺病毒感染后3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期(±s)

表2 腺病毒感染后3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期(±s)

注:實(shí)驗(yàn)組為Ad-NICD組，陰性對(duì)照組為Ad-GFP組，空白對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染腺病毒組;與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05;與陰性對(duì)照組比較，cP＜0.05

組別 G0/G1期 S期 G2/M期實(shí)驗(yàn)組 63．98 ±0．53 36．02 ±0．44ac 0．50 ±0．66陰性對(duì)照組 95．51 ±0．90 2．79 ±0．28 3．70 ±0．73空白對(duì)照組96．83 ±0．78 2．62 ±0．11 2．03 ±0．59

2.6 Western Blot檢測(cè)hUCMSCs中Notch1蛋白的表達(dá) 提取各組培養(yǎng)3 d的hUCMSCs的總蛋白，Western Blot檢測(cè)Notch1蛋白的表達(dá)，圖形軟件分析條帶灰度值，按照公式(Notch1灰度值/Actin灰度值)計(jì)算Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量。Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組為(1．385±0．156)倍，空白對(duì)照組為(0．361±0．075)倍，陰性對(duì)照組為(0．423±0．054)倍，實(shí)驗(yàn)組高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。證實(shí)腺病毒Ad-NICD轉(zhuǎn)染hUCMSCs后，可顯著促進(jìn)細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)，見圖5、6。

表3 不同時(shí)點(diǎn)3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞黏附率(± s，%)

表3 不同時(shí)點(diǎn)3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞黏附率(± s，%)

注:實(shí)驗(yàn)組為Ad-NICD組，陰性對(duì)照組為Ad-GFP組，空白對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染腺病毒組;與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05;與陰性對(duì)照組比較，cP＜0.05

時(shí)間(h)實(shí)驗(yàn)組 陰性對(duì)照組 空白對(duì)照組4 16．18 ±3．08 13．60 ±3．44 15．33 ±4．31 8 28．89 ±2．75 24．43 ±4．31 24．58 ±3．20 12 76．79 ±3．64ac 52．08 ±4．58 51．81 ±4．08 16 88．78 ±5．43ac 70．55 ±3．57 63．31 ±6．84 20 103．48 ±4．29ac 88．01 ±5．06 87．31 ±6．84 24 102．20 ±4．33 94．86 ±4．65 95．52 ±1．90

圖3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力觀察(Giemsa×40)

3 討論

干細(xì)胞的定向遷移、局部黏附并增殖稱為干細(xì)胞的歸巢作用。當(dāng)組織損傷發(fā)生后，骨髓會(huì)迅速動(dòng)員多種干細(xì)胞遷移至病變部位，產(chǎn)生自然的代償性修復(fù)作用，而通過各種途徑移植的外源性干細(xì)胞，也會(huì)定向歸巢至損傷部位，發(fā)揮治療作用。干細(xì)胞歸巢效率是干細(xì)胞移植治療心肌梗死、脊髓損傷、帕金森病、老年癡呆等疾病的關(guān)鍵因素，但其機(jī)制尚未完全清楚。目前關(guān)于干細(xì)胞遷移研究較多的是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor，SDF-1)及其受體CXCR4。體內(nèi)研究表明，hUCMSCs受到了腫瘤細(xì)胞分泌SDF-1和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelil growth factor，VEGF)等趨化因子的誘導(dǎo)而向腫瘤組織遷移，可作為穩(wěn)定、有效的藥物載體及基因治療載體，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或抗腫瘤藥物等作靶向治療，能有效縮小實(shí)體腫瘤體積［6-7］。

圖4 Transwell小室測(cè)定3組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞遷移能力

圖5 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch1蛋白的表達(dá)情況

圖6 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch1蛋白的相對(duì)表達(dá)量半定量分析

在組織損傷修復(fù)中，損傷部位血供的恢復(fù)及改善是決定修復(fù)作用的關(guān)鍵因素，僅僅單純應(yīng)用細(xì)胞因子促進(jìn)修復(fù)不足以達(dá)到復(fù)雜的創(chuàng)傷愈合或局部血管再生的目的，而干細(xì)胞聯(lián)合基因?qū)胫委煹膽?yīng)用可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化、細(xì)胞因子及生長因子的旁分泌、促血管新生等聯(lián)合作用機(jī)制來影響局部微環(huán)境，從而有效地促進(jìn)傷口愈合，縮短治療時(shí)間［8-9］。

1993年由Hockel等最早提出的應(yīng)用治療性血管新生療法，是指通過血管新生因子的作用，刺激局部血管的再生而形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)，使其與局部細(xì)胞、組織的生理需求相適應(yīng)，達(dá)到保護(hù)損傷組織及修復(fù)再建的治療目的，是目前缺血性疾病治療、創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生等領(lǐng)域備受矚目的研究重點(diǎn)［10］。血管新生是指干細(xì)胞通過誘導(dǎo)、分化而形成內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，EPC對(duì)缺血缺氧及損傷炎癥部位具有趨化歸巢作用，定位遷移、黏附后增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞，最終分化成熟并與原有血管相連接，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)［11］。血管新生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，多種生長因子、細(xì)胞因子及多種細(xì)胞參與其中，受到復(fù)雜的信號(hào)通路的調(diào)控。

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、轉(zhuǎn)錄因子CSL(一類DNA結(jié)合蛋白)和下游效應(yīng)物組成?，F(xiàn)有研究表明，Notch信號(hào)通路在促進(jìn)EPC增殖、分化及動(dòng)靜脈轉(zhuǎn)化并維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)、血管生成中有重要的調(diào)控作用［12］。Notch信號(hào)通路通過靶細(xì)胞直接接受相鄰細(xì)胞刺激的側(cè)向激活效應(yīng)，可將信號(hào)直接傳遞到細(xì)胞核，然后進(jìn)一步激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，避免其他信號(hào)的干擾，特異性強(qiáng)，利于細(xì)胞分化起始過程的精確調(diào)控［4］。Notch1在乳腺癌組織中表達(dá)高于周圍正常組織，和雌激素受體(ER)、HER-2等分子分型的表達(dá)關(guān)系密切，是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素［13-14］，同時(shí)Notch1的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力呈高度正相關(guān)，阻斷該通路可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移［15］。金屬蛋白酶(MMPs)是一組非溶酶體酶的蛋白水解酶，是使胞外基質(zhì)降解的主要酶。在對(duì)培養(yǎng)15～18代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅表達(dá)SDF-1/CXCR4，同時(shí)表達(dá)間充質(zhì)MMPs，能降解細(xì)胞外基質(zhì)，有助于干細(xì)胞的動(dòng)員和遷移歸巢［16-17］，而缺氧微環(huán)境與MMPs的分泌表達(dá)密切相關(guān)［18］。在胰腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境可激活Notch1信號(hào)途徑，誘導(dǎo)MMP-2及MMP-9表達(dá)，與基底膜表面受體如纖維連接蛋白和層黏蛋白結(jié)合，進(jìn)而降解基底膜和基質(zhì)，最后使腫瘤細(xì)胞能夠向周圍組織浸潤［19］。

本研究中，我們以hUCMSCs為研究對(duì)象，通過前期制備的人Notch1受體胞內(nèi)活性片段NICD重組腺病毒Ad-NICD轉(zhuǎn)染，觀察Notch1基因?qū)UCMSCs細(xì)胞增殖、黏附及遷移能力的影響。Ad-NICD和Ad-GFP轉(zhuǎn)染后的hUCMSCs可表達(dá)GFP蛋白，證實(shí)了腺病毒成功轉(zhuǎn)染入了hUCMSCs。通過MTT檢測(cè)，Ad-NICD具有促進(jìn)hUCMSCs增殖的作用，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例顯著增高，說明細(xì)胞DNA復(fù)制活躍，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)。細(xì)胞貼壁實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在hUCMSCs消化培養(yǎng)早期，Ad-NICD能促進(jìn)細(xì)胞黏附，而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，其促進(jìn)作用不明顯。Transwell小室觀察細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著大于空白對(duì)照組，提示Notch1信號(hào)通路激活能提高細(xì)胞遷移能力。同時(shí)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞高表達(dá)Notch1蛋白，進(jìn)而證實(shí)了Notch1具有促進(jìn)hUCMSCs細(xì)胞增殖、黏附及遷移的作用。

本研究結(jié)果表明，Notch1具有促進(jìn)hUCMSCs細(xì)胞增殖、黏附及遷移的作用。我們可以通過將外源Notch1基因?qū)雋UCMSCs，提高干細(xì)胞的歸巢效率，增強(qiáng)其組織損傷修復(fù)及血管新生的能力。本研究僅僅開展了關(guān)于Notch1基因?qū)雋UCMSCs后，細(xì)胞生物學(xué)特征改變的研究，其具體作用機(jī)制及SDF-1/CXCR4、MMPs等與細(xì)胞歸巢密切相關(guān)分子的表達(dá)，將是下一步的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

［1］ Fu Y S，Cheng Y C，Lin M Y，et al．Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton＇s jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic application for Parkinsonism［J］．Stem Cells，2006，24(1):115-124．

［2］ Can A，Karahuseyinoglu S．Concise review:human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells［J］．Stem Cells，2007，25(11):2886-2895．

［3］ Yu G，Borlongan C V，Stahl C E，et al．Systemic delivery of umbilical cord blood cells for stroke therapy:a review［J］．Restor Neurol Neurosci，2009，27(1):41-54．

［4］ Artavanis Tsakonas S，Rand M D，Lake R J．Notch signaling:cell fate control and signal integration in development［J］．Science，1999，284(5415):770-776．

［5］ Bray S J．Notch signalling:a simple pathway becomes complex［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7(9):678-689．

［6］ Rachakatla R S，Marini F，Weiss M L，et al．Development of human umbilical cord matrix stem cell-based gene therapy for experimental lung tumors［J］．Cancer Gene T-her，2007，14(10):828-835．

［7］ Rachakatla R S，Pyle M M，Ayuzawa R，et al．Combination treatment of human umbilical cord matrix stem cellbased interferon-beta gene therapy and 5-fluorouracil significantly reduces growth of metastatic human breast cancer in SCID mouse lungs［J］．Cancer Invest，2008，26(7):662-670．

［8］ Lu F，Li J，Gao J．Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by using VEGF-transfected adipose-derived stem cells［J］．Plast Reconstr Surg，2009，124(5):1437-1446．

［9］ Zhu M，Zhou Z，Chen Y．Supplementation of fat grafts with adipose-derived regenerative cells improves long-term graft retention［J］．Ann Plast Surg，2010，64(2):222-228．

［10］ Hockel M，Schlenger K，Doctrow S，et al．Therapeutic angiogenesis［J］．Arch Surg，1993，128(4):423-429．

［11］ Li B，Sharpe E E，Maupin A B，et al．VEGF and PlGF promote adult vasculogenesis by enhancing EPC recruitment and vessel formation at the site of tumor neovascularization［J］．FASEB J，2006，20(9):1495-1497．

［12］ Ii M，Takeshita K，Ibusuki K．Notch signaling regulates endothelial progenitor cell activity during recovery from arterial injury in hypercholesterolemicmice［J］．Circulation，2010，121(9):1104-1112．

［13］ Magnifico A，Albano L，Campaner S，et al．Tumor-initiating cells of HER2-positive carcinoma cell lines express the highest oncoprotein levels and are sensitive to trastuzumab［J］．Clin Cancer Res，2009，15(6):2010-2021．

［14］ Hao L，Rizzo P，Osipo C．Notch-1 activates estrogen receptor-alpha-dependent transcription via IKKalpha in breast cancer cells［J］．Oncogene，2010，29(2):201-213．

［15］ 逯翀，劉春萍，趙向旺，等．Notch1表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的相關(guān)性［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，41(6):647-649，655．

［16］ Shirvaikar N，Marquez Curtis L A，Shaw A R．MT1-MMP association with membrane lipid rafts facilitates GCSF induced hematopoietic stem/progenitor cell mobilization［J］．Exp Hematol，2010，38(9):823-835．

［17］ Avigdor A，Goichberg P，Shivtiel S，et al．CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/progenitor cells to bone marrow［J］．Blood，2004，103(8):2981-2989．

［18］ Annabi B，Lee Y T，Turcotte S．Hypoxia promotes murine bone-marrow-derived stromal cell migration and tube formation［J］．Stem Cells，2003，21(3):337-347．

［19］ Wang Z，Banerjee S，Li Y，et al．Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factorkappaB，vascular endothelial growth factor，and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells［J］．Cancer Res，2006，66(5):2778-2784．