陳爽 趙清來

凡是由各種因素引起的晶狀體混濁均稱為白內障，是全世界致盲的主要原因，其中最常見的就是老年性白內障，年齡越大發(fā)病率越高，但它的發(fā)病機制尚不完全清楚。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一種進化上高度保守的細胞應激蛋白，可以保護機體在嚴酷的環(huán)境下得以生存。近年來，HSPs的表達與疾病的關系一直被人們所關注，其在晶狀體上皮細胞中表達的特點也成為眼科界研究的一大熱點。為探討HSP27、HSP70在老年性白內障的形成中是否存在作用，我們利用免疫組化方法觀察晶狀體上皮細胞中HSP27、HSP70的表達特點，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 隨機收集2007～2010年本院住院確診為老年性白內障行小切口白內障超乳手術患者102例，男性48例，女性54例，年齡53～88歲，平均(73.55±8.24)歲，其中皮質型36例，核型35例，后囊下型31例。病例均排除高度近視，葡萄膜炎，眼底病變等眼科其他疾病及糖尿病等影響晶狀體代謝的全身性疾病。對照組取自健康尸體眼晶狀體前囊膜5例，為青壯年。

1.2 晶狀體前囊膜的采集及保存 撕取晶狀體中央前囊膜，用生理鹽水干凈后，置于40 g/L多聚甲醛中固定，石蠟包埋，-25℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HSP27、HSP70免疫組織化學觀察

1.3.1 試劑 一抗：鼠抗人HSP27單克隆單體(1：100稀釋)；鼠抗人HSP70單克隆單體(1：80稀釋)；二抗：Envision試劑；DAB顯色劑及Envision免疫組織化學試劑盒；PBS和TBS緩沖液。

1.3.2 實驗步驟 取組織蠟塊制成石蠟切塊平鋪于涂有APES的載玻片上，58℃烤24 h，二甲苯脫蠟，乙醇水化。PBS浸泡3 min×3次，3%H2O2室溫孵育5～10 min。PBS浸泡3 min×3次，將切片置于0.01 molCB液中，98℃微波修復10 min，自然冷卻至室溫。PBS浸泡3 min×3次，加正常血清封閉，室溫作用15 min。傾去多余水分，勿洗。加適量稀釋的一抗，37℃水浴1～2 h。PBS浸泡3 min×3次，加 Envision試劑，37℃水浴10～15 min。PBS浸泡3 min×3次，DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.3 標本檢測 用已知陽性標本作陽性對照，用PBS代替一抗，結果應為陰性。陽性為細胞核/漿著染為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀彌漫分布。每張切片隨機觀察5個視野，并記錄陽性細胞率。陽性細胞率為5個視野內陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。陽性細胞的分級標準為：-陰性；+陽性細胞＜5%；++陽性細胞5% ～25%；+++陽性細胞25% ～50%；++++陽性細胞50% ～75%；+++++陽性細胞＞75%。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0軟件，以秩和檢驗對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

老年性白內障與正常晶狀體上皮中均有HSP27、HSP70的表達，但各不相同。

HSP27在正常對照組晶狀體上皮細胞中的表達為(28.40±4.05)%，而在老年性白內障晶狀體上皮細胞中的表達：皮質型為(76.17±2.38)%，核型為(65.83±1.76)%，后囊下型為(57.71±2.15)%，三者與正常對照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統(tǒng)計學意義，即HSP27的表達皮質型組＞核型組＞后囊下型組。見表1。

表1 HSP27在晶狀體上皮細胞中的表達(n)

HSP70在正常對照組晶狀體上皮細胞中的表達為(29.60±4.95)%，而在老年性白內障晶狀體上皮細胞中的表達：皮質型為(77.31±2.74)%，核型為(63.26±1.76)%，后囊下型為(57.23±2.23)%，三者與正常對照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統(tǒng)計學意義，即HSP70的表達皮質型組＞核型組＞后囊下型組。見表2。

表2 HSP70在晶狀體上皮細胞中的表達(n)

3 討論

所謂白內障是晶狀體老化后的退行性變，是多種因素作用的結果。晶狀體作為身體中蛋白質含量最高的器官，以重量計可高達濕重的35%，而晶狀體的干重幾乎全為蛋白質［1］。因此分析晶狀體蛋白質的變化，是探討白內障的形成機制的一大方向。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物體在不良環(huán)境因素作用下所產生的一組具有高度保守性的特殊蛋白，而且除了因熱刺激而產生以外，還有很多因素，如重金屬、缺氧、病毒或細菌感染等，都可以誘導其產生，因此也有人稱之為應激蛋白［2］。它普遍存在于整個生物界，幾乎所有的細胞均能合成HSPs，從而參與細胞的損傷與修復。Arrigo等［3］發(fā)現(xiàn)，衰老細胞中HSP27的表達量較高，它對過量自由基產生的蛋白氧化，脂質過氧化和DNA損傷都有抑制作用。Li等［4］發(fā)現(xiàn)，HSP70通過抑制線粒體細胞色素 C的釋放及Caspase 3的活化來抑制細胞凋亡。在應激狀態(tài)下，HSP27、HSP70的表達增加發(fā)揮了細胞保護，分子伴侶，信號傳導，凋亡調節(jié)等作用，增強了細胞的耐受能力。

近年來的研究表明，晶狀體能表達一系列的熱休克蛋白，它們對維持晶狀體的穩(wěn)定和透明起到關鍵作用［5］。本實驗采用免疫組織化學染色觀察晶狀體前囊膜上皮細胞中HSP27、HSP70的表達，發(fā)現(xiàn)老年性白內障中 HSP27、HSP70的含量均高于正常對照組，HSP27、HSP70的表達增加有利于阻止蛋白間不必要的相互作用，幫助變性蛋白重新折疊，維持了晶狀體蛋白質的正確構象，從而延緩了白內障的發(fā)展。本實驗通過比較皮質型、核型、后囊下型晶狀體前囊膜上皮細胞中HSP27、HSP70的表達，還發(fā)現(xiàn)各型之間存在顯著差異，其中皮質型HSP27、HSP70的表達＞核型＞后囊下型，故推測這三型白內障的發(fā)生機制可能不同，HSP27、HSP70蛋白在皮質型白內障發(fā)生機制中作用較強，而在后囊下型作用較弱，其具體作用機制有待進一步研究。

總之，我們可以從熱休克蛋白具有抗氧化，分子伴侶，細胞保護等作用入手，探討HSP27、HSP70在老年性白內障發(fā)生機制中的保護作用，為白內障的防治工作提供新視野。

［1］ 劉家琦，李鳳鳴，吳靜安，等．實用眼科學．第二版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：383-404.

［2］ Fuller KJ，Issels RD，Slosman DO，Guillet JG，Soussi T，Polla BS．Cancer and the heat shock response．EurJ Cancer，1994；30A(12)：1884-1891.

［3］ Arrigo AP，Ducasse C．Expression of the anti-apoptotic protein HSP27 during both the keratinocyte differentiation and dedifferentiation of HaCat cells：expression linked to changes in intracellular protein organization．Exp Gerontol，2002；37(10-11)：1247-1255.

［4］ Li CY，Lee JS，Ko YG．Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase 3 activation．J Biol Chem，2000；275(5)：25665-25671.

［5］ Berry Y．Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human．Am J Hum Genet，2001；69：1141-1152．