張 博，鄭聯(lián)合，余雪梅，鐘秋平*

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228;2.海南省糧油科學(xué)研究所，海南 瓊海 571400）

山蘭黃酒是以海南黎族傳統(tǒng)的山蘭旱稻為原料釀制的具有鮮明地方特色的黃酒[1]。傳統(tǒng)制作山蘭黃酒一般有2種方法：一是將山蘭米蒸熟揉散成粒，再將用黎山特定植物和米粉制成的“球餅”碾至粉狀摻入其中，裝進壇里。一日后取少量冷水沁入并封口，埋到芭蕉樹下自然成酒，一年后呈黃褐色，數(shù)載則顯紅色甚至黑色；二是將蒸熟的山蘭米和碾碎的“球餅”混合放置在墊滿芭蕉葉的錐形竹筐中，上面也用芭蕉葉封蓋。3d后，朝下的竹筐尖部開始往筐下的陶罐里滴出漿水，這就是山蘭純液。

清爽型黃酒是黃酒中的新興品種。其生產(chǎn)和開發(fā)雖剛剛起步，卻在短時間內(nèi)成為消費者所喜愛的品種，并逐漸成為一種新的潮流和流派。目前，對清爽型黃酒的研究主要集中在產(chǎn)品開發(fā)及降低一些理化指標(biāo)（如酒精、總糖、總酸、固形物、氨基酸態(tài)氮含量等）方面[2-6]。而對于香氣成分及風(fēng)味物質(zhì)氨基酸等方面的研究鮮見報道。汪建國[7]指出，適量加入傳統(tǒng)淋飯酒母，有利于改進純種酒母釀酒的風(fēng)味，賦予成品酒濃醇鮮爽的口味。本實驗的目的是研究添加不同比例的淋飯酒母對液態(tài)法釀制清爽型山蘭黃酒風(fēng)味的影響，以期為生產(chǎn)清爽淡雅的山蘭黃酒提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山蘭糯米、安琪黃酒干酵母：市售；蔞葉小曲：自制；液化酶、糖化酶：無錫酶制劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；Waters2695液相色譜儀：美國Waters公司；Cemini系統(tǒng)電子鼻：法國Alpha M.O.S公司。

1.3 方法

1.3.1 淋飯酒母的制備

1.3.2 添加淋飯酒母對液態(tài)法發(fā)酵山蘭黃酒品質(zhì)的影響

稱取一定量的米粉，加入9.5U/g的液化酶，100℃液化8.5min，冷卻至57.8℃，加入174.21U/g的糖化酶，糖化6h。糖化完成后冷卻至28℃，分別接入0%、3%、6%和9%的淋飯酒母（以1g/kg糯米的比例添加干酵母，活化后添加），恒溫條件下發(fā)酵，發(fā)酵完成后測定酒精度、還原糖、非糖固形物、總酸、pH值、氨基酸態(tài)氮等指標(biāo)，并進行產(chǎn)品品評。

1.3.3 清爽型山蘭黃酒感官評定及理化指標(biāo)的測定

感官評定及理化指標(biāo)的測定參見國標(biāo)GB/T1362—2008《黃酒》[9]。

1.3.4 山蘭黃酒香氣電子鼻分析

（1）電子鼻系統(tǒng)：法國Alpha M.O.S公司生產(chǎn)的Cemini系統(tǒng)，由6個金屬氧化物型半導(dǎo)體傳感器（P30/1對可燃氣體，有機化合物敏感、P40/2氧化能力較強的氣體靈敏、T70/2對芳香族化合物靈敏、PA/2對乙醇、氨氣/有機胺類靈敏、LY2/GH對有毒氣體靈敏，如氨、胺類物質(zhì)，LY2/gCTI對有毒氣體靈敏，如H2S）及其陣列組合而成。

（2）電子鼻分析參數(shù)：取1mL的樣品加29mL水混勻，再取混合液1mL加入頂空進樣瓶中，35℃孵化5min，每針0.25mL氣體。

（3）樣品的統(tǒng)計學(xué)分析：利用電子鼻自帶的Alphasoft 11.0統(tǒng)計分析軟件，主成分分析（principal component analysis，PCA）和判別因子分析（discriminal factor analysis，DFA）進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.5 氨基酸分析

取10mL樣品加入10%磺基水楊酸10mL混合均勻，于4℃放置2h，1000r/min離心15min，中速濾紙過濾后，用4mol/L NaOH調(diào)整濾液pH值至8.0，并定容至25mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，用AccQ·Fluor Reagent Kit（P/N WAT052880）進行衍生處理后，用HPLC外標(biāo)法測定樣品中的游離氨基酸含量。

1.3.6 統(tǒng)計分析

全部數(shù)據(jù)均采用SPSS（11.0）統(tǒng)計軟件進行方差分析，用鄧肯氏新復(fù)級差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同比例淋飯酒母的發(fā)酵曲線

以不添加淋飯酒母（添加純種酒母發(fā)酵）為對照（CK），添加3%、6%和9%淋飯酒母的發(fā)酵曲線見圖1。由圖1可知，只添加純種酒母的發(fā)酵曲線與添加淋飯酒母的發(fā)酵曲線變化趨勢相似。發(fā)酵前3d，二氧化碳失重隨著發(fā)酵時間的延長而增加，并在第3d時失重達到最大值，說明此時發(fā)酵達到最旺盛。此后，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵逐漸減弱，至第12d時主發(fā)酵基本完成。與對照相比，添加淋飯酒母的發(fā)酵過程相對較平緩，特別是在發(fā)酵前6d，添加淋飯酒母的二氧化碳失重皆比對照低。添加不同比例淋飯酒母間的二氧化碳失重在整個發(fā)酵期間差異并不顯著。

圖1 添加不同比例淋飯酒母的發(fā)酵曲線圖Fig.1 Fermentation curve of adding Lin-fan yeast with different ratio

2.2 添加不同比例淋飯酒母的發(fā)酵結(jié)果

添加不同比例淋飯酒母發(fā)酵所得酒樣的理化指標(biāo)見表1，酒樣感官評價結(jié)果見表2。由表1、表2可知，所釀制的山蘭黃酒各項常規(guī)理化指標(biāo)及香氣基本上達到清爽型國標(biāo)GB13662—2008《黃酒》的要求。添加不同比例的淋飯酒母進行發(fā)酵，對總糖、非糖固形物、總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、酒精度及pH值等皆有不同程度的影響。從初步釀酒的結(jié)果中看，對總糖而言，添加3%及9%的淋飯酒母，與不加淋飯酒母所得酒樣的總糖差異顯著，添加不同比例淋飯酒母間差異顯著；對非糖固形物而言，添加與不添加淋飯酒母間、添加不同比例的淋飯酒母間差異顯著；對總酸而言，各樣品間差異顯著；對pH值而言，添加與不添加淋飯酒母間差異顯著，而添加淋飯酒母間差異不顯著，總酸含量增加而pH值下降不顯著可能是由于增加的酸解離程度?。粚Π被釕B(tài)氮而言，各樣品間差異顯著；對酒精度而言，添加不同比例淋飯酒母間的差異不顯著，說明即使添加3%的淋飯酒母也能滿足發(fā)酵的需要。添加淋飯酒母的酒精度與不加淋飯酒母的酒精度差異顯著，但發(fā)酵能力較弱，酒精度較低。

表1 添加不同比例的淋飯酒母發(fā)酵所得的酒樣結(jié)果Table 1 Results of samples fermented with Lin-fan yeast by adding different ratio

表2 山蘭黃酒感官評定結(jié)果Table 2 Sensory evaluations of Shanlan rice wine

2.3 添加不同比例淋飯酒母所得酒樣香氣傳感器信號分析

添加不同比例淋飯酒母的酒樣雷達圖見圖2，電子鼻不同感應(yīng)器對不同酒樣的感應(yīng)情況見表3。從雷達圖及感應(yīng)器響應(yīng)值可以看出，添加不同比例淋飯酒母對山蘭黃酒的香氣成分的感應(yīng)存在較大差異，其中PA/2和T70/2傳感器對山蘭黃酒香氣成分感應(yīng)最強烈，最大感應(yīng)值能達到1.004和0.524，而LY2/Gh和LY2/g CTI感應(yīng)器對山蘭黃酒感應(yīng)最小，其最大感應(yīng)值也只有0.032和0.024。對于各種感應(yīng)器而言，添加3%淋飯酒母制備的山蘭黃酒香氣成分的感應(yīng)值最大，與不加淋飯酒母的山蘭黃酒相比，其感應(yīng)值差異顯著，說明添加淋飯酒母制備山蘭黃酒比直接添加活化的活性干酵母制備山蘭黃酒香氣成分更加濃郁。而添加6%或9%的淋飯酒母制備的山蘭黃酒香氣在多數(shù)情況下與不加淋飯酒母的樣品差異不顯著，可能的原因是添加的淋飯酒母量過大，發(fā)酵較劇烈，香氣成分損失多，從發(fā)酵曲線也可以看出添加3%的淋飯酒母的發(fā)酵曲線較為平緩，利于香氣的保持。

圖2 添加不同比例淋飯酒母制備的山蘭黃酒雷達圖Fig.2 Radar chart of Shanlan rice wine fermentation by Lin-fan yeast with different ratio

2.4 添加不同含量淋飯酒母所得酒樣的主成分分析

主成分分析是將傳感器所提取的多指標(biāo)信息數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維處理，找出若干個綜合因子來代表原來眾多的變量，使得這些綜合因子盡可能多地反映原來變量的信息，而彼此之間互不相干。對降維處理的特征向量進行線性分類，最后在PCA分析的散點圖上顯示主要的兩維散點圖，以達到簡化的目的[10]。第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）包含了在轉(zhuǎn)換中得到的第1主成分和第2主成分的貢獻率，貢獻率越大，說明降維后的綜合指標(biāo)能更多地反映原來多指標(biāo)的信息。利用電子鼻對添加不同比例淋飯酒母制備的山蘭黃酒香氣成分分析的結(jié)果見圖3。

表3 傳感器對添加不同比例淋飯酒母山蘭黃酒的響應(yīng)值Table 3 Sensor response of Shanlan rice wine fermentation by Lin-fan yeast with different ratio

圖3 添加不同比例淋飯酒母制備的山蘭黃酒的主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of Shanlan rice wine fermentation by Lin-fan yeast with different ratio

從圖3可見，PC1解釋了酒樣間99.41%的差異，PC2解釋了酒樣間0.40%的差異。通過PC1可以將不加淋飯酒母的酒樣及添加3%淋飯酒母的酒樣區(qū)分開來，不加淋飯酒母的酒樣分布在PC1的右半部分，添加3%淋飯酒母的酒樣則分布在左半部分；添加6%及9%淋飯酒母制備的酒樣與不加淋飯酒母的酒樣部分從重疊，通過PCA很難對酒樣做出進一步的判斷，說明這3個樣品之間既有相似，也存在差異。

2.5 添加不同比例淋飯酒母所得酒樣的判別因子分析（DFA）

DFA是在PCA的基礎(chǔ)上，對數(shù)據(jù)進一步優(yōu)化處理，在更大程度上區(qū)分不同氣味的一種方法[11]。通過對不同樣品分組，剔除干擾因素，擴大不同組分間差異，從而能夠顯著提高氣味的差異[12-13]。圖4即為電子鼻傳感器的DFA區(qū)分圖。與圖3相比，圖中各組分的差異明顯擴大。從DFA圖上分析得出：通過DF1可將不加淋飯酒母的酒樣與添加淋飯酒母的酒樣完全區(qū)分開來，不加淋飯酒母制備的山蘭黃酒分布在DF1的右半部分，而添加淋飯酒母制備的山蘭黃酒分布在DF1的左半部分。此結(jié)果進一步表明，液態(tài)法釀制山蘭黃酒過程中添加淋飯酒母進行發(fā)酵有利于增強黃酒的香氣。

圖4 添加不同比例的淋飯酒母制備的山蘭黃酒的判別因子分析圖Fig.4 Discriminant factor analysis of Shanlan rice wine fermentation by Lin-fan yeast with different ratio

表4 添加不同比例淋飯酒母制備的山蘭黃酒氨基酸成分Table 4 Amino acids analysis of Shanlan rice wine fermentation by Lin-fan yeast with different ratio

2.6 添加不同比例淋飯酒母所得酒樣的氨基酸成分分析

氨基酸是黃酒的主要營養(yǎng)成分之一，具有鮮、甜、苦、澀、酸等多種味感。黃酒中的氨基酸含量要適宜，且配伍合理，才能賦于黃酒良好的滋味。據(jù)李博斌等[14]的研究表明，16種主要氨基酸與黃酒口味之間的相關(guān)性比較大，有10種達到了極顯著水平，其中天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸為正相關(guān)，而蛋氨酸、組氨酸、精氨酸呈負相關(guān)。

添加不同比例淋飯酒母制備的山蘭黃酒的氨基酸含量及種類見表4。由表4可知，液化法生產(chǎn)的山蘭黃酒與其他液化法黃酒、傳統(tǒng)黃酒相比氨基酸種類較少、總量較低，符合清爽型黃酒的特征。氨基酸總量較低可能與山蘭米所含蛋白質(zhì)較低有關(guān)，山蘭米所含蛋白質(zhì)約為4.7g/100g，而一般的糯米所含蛋白質(zhì)達7.5g/100g左右。山蘭黃酒的甜味氨基酸與苦味氨基酸的比值較高，與一般的液化黃酒（0.7）、清爽型黃酒（0.6）、傳統(tǒng)黃酒（0.7）相比[15]，不加淋飯酒母發(fā)酵的山蘭黃酒甜味氨基酸/苦味氨基酸比值約為1.0，添加3%、6%、9%淋飯酒母的山蘭黃酒分別為1.3、0.9及1.9，這可能是導(dǎo)致山蘭黃酒后苦較輕的主要原因。

3 結(jié)論

3.1 利用淋飯酒母取代純種酒母發(fā)酵，添加3%淋飯酒母發(fā)酵平緩，所得山蘭黃酒香氣濃郁。

3.2 通過電子鼻主成分分析及判別因子分析，能很好區(qū)分純種酒母發(fā)酵及添加淋飯酒母發(fā)酵的酒樣，純種酒母發(fā)酵的酒樣香氣與3%淋飯酒母發(fā)酵的酒樣香氣差異顯著。

3.3 通過氨基酸成分分析，添加淋飯酒母的山蘭黃酒游離氨基酸總量更低，口感更加清爽。

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