鄭壽煥 楊秀麗 姚慶春 李 蘭 車惠英 王敬銜

1.延邊大學附屬醫(yī)院內分泌科，吉林延吉 133000；2.吉林油田總醫(yī)院內分泌科，吉林松原 138000

糖尿病是一種遺傳和環(huán)境多種因素綜合作用的疾病，近年來研究提示，部分糖尿病的發(fā)生與線粒體基因突變有一定的關聯[1-2]。WHO將線粒體基因突變型糖尿病歸認為特殊類型的糖尿病。由于不同種族、不同地區(qū)的2 型糖尿?。═2DM）患者中線粒體基因的突變率不同，線粒體基因突變與糖尿病關系的報道不一。本研究對延邊地區(qū)328例T2DM 患者（其中2例合并耳聾）及108例正常對照組線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域基因進行突變分析，旨在探討延邊地區(qū)T2DM 患者中線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域基因突變情況及了解該地區(qū)該區(qū)域線粒體基因突變與T2DM的關系，進而從中篩選出線粒體基因突變型糖尿病。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2009年12月～2012年2月在延邊大學附屬醫(yī)院健康體檢者108例，其中，男65例，女43例，平均年齡（30.4±9.7）歲，作為正常對照組，臨床和實驗室檢查均正常，排除肝、腎、內分泌和心腦血管疾病，近3個月無服用任何藥物史；選取同時期在延邊大學附屬醫(yī)院內分泌科住院的T2DM 患者328例作為2 型糖尿病組，其中，男194例，女134例，平均年齡（35.1±6.9）歲。糖尿病診斷依據1999年WHO 診斷標準，排除妊娠、急性感染、腫瘤、外傷、心、肝疾病及服用羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶抑制劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物者。所有受檢對象均為延邊地區(qū)無血緣關系個體，均簽署知情同意書。兩組一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究均在醫(yī)院倫理委員會通過情況下進行研究。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用Promega公司生產的Wizard@Genomic DNA Purification Kit 提取DNA。取被受檢者肘靜脈血2 mL 到加有EDTA 抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻，置于離心機中3 000 r/min離心10 min，取300 μL 白細胞加入到1.5mL離心管中，按照細胞裂解、核裂解、RNA 去除、沉淀蛋白質、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過程分別加入試劑，進行DNA的提取。所得DNA經紫外分光光度計定量，并置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴增mtDNA 3160～3755 區(qū)域基因片段 根據GenBank 中的序列參考文獻報道[2]，采用長春百奧生物技術有限公司合成上游引物：5'-AGCGCCTTCCCCGGTAAATGA-3'， 下游引物：5'-AGAATGATGGCTAGGGTGACTTC-3'。 PCR 擴增體系 （50 μL）包括：5 ×Green GO Taq Buffer 10 μL，MgCl22 μL，dNTP 1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.25μL， 滅菌注射用水29.75μL，DNA 5μL；PCR 循環(huán)參數：95℃預變性 5min，94℃變性 45s，56℃退火 35s，72℃延伸 45s， 循環(huán) 35次，最后72℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴增產物。

1.2.3 PCR 產物的限制性酶切 20 μL 酶切體系包括：PCR產物 5μL，HaeⅢ內切酶 0.5μL， 滅菌注射用水 14.5μL，置于37℃水浴箱中水浴4 h。5%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物。

1.2.4 PCR 擴增產物直接測序 PCR 產物用凝膠電泳DNA回收試劑盒純化回收DNA 片段后，送北京奧萊博生物技術有限責任公司，完成PCR 擴增產物測序。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術檢測情況

線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域經PCR 擴增后得到產物片段長度為596 bp，見圖1。限制性內切酶HaeⅢ酶切位點為GG↓CC， 無突變者在位點3316、3413、3428 和3608 處存在酶切識別點， 得到的片段長度為180、159、147、97 和15bp 5個片段， 如果位點 3243、3316、3394、3593、3714 發(fā)生突變，則產物片段的數量和長度均會改變。根據限制內切酶HaeⅢ酶切片段情況得到兩種圖譜，見圖2～3，其中，圖2 為線粒體基因3316 位點發(fā)生突變，圖3 為線粒體基因3394 位點發(fā)生突變。

2.2 直接測序法檢測情況

直接測序發(fā)現線粒體基因3316 位點發(fā)生G→A 變異，3394 位點發(fā)生T→C 變異。見圖4～5（見封三）。

2.3 線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域各位點突變情況

在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變12例，突變率為3.7%，在108例正常對照組中檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變4例，突變率為3.8%（P＞0.05）；在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA3394 T→C 突變24例，突變率為7.3%，在108例正常對照組中檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變2例，突變率為1.8%（P＜0.05）；在328例T2DM 患者中及108例正常對照組中均未檢測到線粒體 DNA3243 A→G、3593T→C 和 3714 A→G突變。

3 討論

線粒體基因突變糖尿病被WHO公認為一種特殊類型的糖尿病，目前根據發(fā)病特點和一般的常規(guī)檢查很難確診，臨床上一般按照T2DM 進行診療。因此，本實驗旨在了解延邊地區(qū)線粒體基因3160～3755 區(qū)域基因突變情況，進而從中篩選出線粒體基因突變型糖尿病，采取針對性的個性化治療。

線粒體是細胞內的動力工廠，它主要通過氧化磷酸化功能為生物組織和細胞提供能量和ATP 進行生命活動。線粒體DNA是具有自我復制、轉錄和翻譯功能的環(huán)狀雙鏈DNA分子。線粒體DNA 3316 和3394 突變均位于呼吸鏈復合物NADH 脫氫酶第1 亞單位（ND1）基因的高度保守區(qū)，線粒體DNA3316 G→A 突變使丙氨酸被蘇氨酸替換，3394 T→C 點突變使酪氨酸變成組氨酸，上述兩位點突變均改變了NADH 脫氫酶（復合體）亞單位1的二級結構，從而影響呼吸鏈復合體Ⅰ酶活性，影響線粒體氧化磷酸化的能力，ATP 生成減少，降低胰島細胞分泌胰島素的能力，使胰島素作用缺陷，從而誘發(fā)糖尿病[1]。關于不同地域不同種族中該位點突變與糖尿病關系的報道結論不一致。

國外學者研究認為，在糖尿病人群中3316 G→A 突變率為3.4%，而在正常人群中檢出3316 突變率為1.0%，且兩組檢出率差異有統(tǒng)計學意義[3]。Nakagawa 等[4]認為線粒體DNA 3316 G→A 突變是T2DM的致病性基因突變。Deng等[5]研究結果顯示，線粒體DNA 3316 G→A 突變不是糖尿病發(fā)病的主要易感基因，可能只引起T2DM的發(fā)病風險性增高，間接地說明線粒體DNA 3316 G→A 突變在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中不起主要作用。也有研究報道該基因突變僅為人群中的基因多態(tài)性，與T2DM的發(fā)生無關[6-7]。本實驗在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變12例，突變率為3.7%；在108例正常對照組中檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變4例，突變率為3.8%（P＞0.05），提示線粒體 DNA 3316 G→A 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生可能無關，考慮可能與線粒體基因的閾值效應特性有關。

日本研究證實，線粒體DNA 3394 T→C 在糖尿病中的突變率為4.9%，在正常人群中為1.3%，二者之間差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示線粒體DNA 3394 T→C 與糖尿病的發(fā)生有一定的相關性[8]。國內報道在T2DM 人群中3394 T→C 突變率為3.0%～6.0%，正常人群為0～2.06%[9]。本課題在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變24例，其突變率為7.3%；在108例正常對照組中檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變2例，其突變率為1.9%（P＜0.05）。經統(tǒng)計分析后認為，線粒體DNA 3394 T→C 變異與延邊地區(qū)T2DM 有一定的相關性。筆者認為線粒體DNA 3394 T→C 突變可能屬于線粒體突變糖尿病。

早在1992年有學者報道了一個母系遺傳的伴有耳聾的糖尿病家系，證實該家系中存在線粒體DNA tRNA leu（UUR）3243 A→G的突變[10]。而中國云南的225例糖尿病人群中未檢出該位點的突變[7]。本研究在糖尿病合并耳聾的2例患者中未發(fā)現3243 位點的突變，在2 型糖尿病組及正常對照組均未檢測到3593、3714 位點的突變，考慮可能上述位點的突變率極低，有待擴大樣本量進一步的研究。

綜上所述，筆者認為線粒體DNA 3316 G→A 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生無關；線粒體DNA 3394 T→C 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生有關；線粒體DNA 3423 A→G，3593 T→C，3714 A→G 突變在延邊地區(qū)T2DM 中的突變率為0，提示上述位點基因突變率極低。

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