劉遠(yuǎn)佳，鄭國超，劉 田，任邵娜，李雅文，孟祥龍，Loutou H M，李國清

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

錫蘭鉤蟲(Ancylostoma ceylanicum)屬于線蟲綱、圓線目、鉤口科、鉤口屬，成蟲常寄生于犬、貓等多種哺乳動(dòng)物消化道，通過吸食宿主血液而引起宿主貧血，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡[1]。Wijers等和Carroll等分別于1966年和1986年以實(shí)驗(yàn)感染的方式證明了人體能夠感染錫蘭鉤蟲[2-3]。而人體自然感染錫蘭鉤蟲的病例在世界各地均有報(bào)道，如澳大利亞、荷蘭、印度、菲律賓、老撾等[1,4-7]。這表明錫蘭鉤蟲是一種重要的人畜共患寄生蟲。研究顯示，犬貓錫蘭鉤蟲感染呈現(xiàn)地方性流行，主要分布在東南亞及澳洲一些國家，我國正位于犬貓錫蘭鉤蟲的流行區(qū)，然而我國關(guān)于貓錫蘭鉤蟲的報(bào)道卻很少，自金大雄1965年首次在貴州家貓?bào)w內(nèi)發(fā)現(xiàn)錫蘭鉤蟲，Yoshida等1968年首次報(bào)道了我國臺(tái)灣省貓錫蘭鉤蟲感染至今，已有近半個(gè)世紀(jì)未見貓錫蘭鉤蟲感染的報(bào)道[8-9]。本研究從廣州市流浪貓糞便樣品中分離到鉤蟲蟲卵，通過直接提取蟲卵基因組DNA，并以鉤蟲ITS1rDNA作為分子標(biāo)記，采用PCR方法快速準(zhǔn)確地將其鑒定為錫蘭鉤蟲，為錫蘭鉤蟲的分子生物學(xué)和分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣 品 貓新鮮血便樣品來源于一只10月齡雌性波斯貓，經(jīng)60目過濾篩過濾兩次，4500r/m in離心10min，棄上清液，沉淀中加入2倍體積2.5%重鉻酸鉀溶液，4℃保存待檢；對(duì)照樣品為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲教研室保存的犬鉤蟲蟲卵。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、DL2000DNA Marker、pMD18-T載體、JM 109感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；蛋白酶K、DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.3 顯微鏡檢測(cè) 取血便樣品的重鉻酸鉀混合液1m L～2m L，加入2倍體積蒸餾水，4000r/min離心5min，棄上層液，加入適量飽和氯化鈉溶液混勻，1500r/m in離心3m in，加入飽和氯化鈉溶液至滿管，在其上放置一蓋玻片，靜置5m in，將蓋玻片置于載玻片上，盧戈氏碘液染色，在400×顯微鏡下觀察。

1.4 蟲卵的純化 將糞樣重鉻酸鉀混合液加入2倍體積蒸餾水，4000r/m in離心10m in，沉淀中加入4倍體積飽和蔗糖溶液懸浮，1500r/m in離心5min，取上清液，加入5倍體積蒸餾水，6000r/min離心10m in，洗滌直至沉淀純凈。

1.5 基因組DNA的提取 將純化蟲卵4000r/m in離心5m in，棄大部分上清液，加入適量玻璃珠，100℃水浴加熱5min，立即置于-80℃冷凝5min，反復(fù)5次，4000r/min離心5m in，棄上清液，加入適量緩沖液和蛋白酶K，漩渦振蕩30m in，55℃水浴消化16h。按糞便DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.6 ITS1-5.8SrDNA部分序列的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 以錫蘭鉤蟲(DQ381541、DQ780009)、管型鉤蟲(JQ812691)、 犬 鉤 蟲 (AM 85010、AM 850105)、 巴 西鉤蟲(DQ359149、DQ438056)、狹頭鉤蟲(HQ262053、AF194145)ITS rDNA序列作為參考，設(shè)計(jì)鉤口屬保守引物AF：5'-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3'和AR：5'-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3'，對(duì)貓?jiān)淬^蟲ITS1+rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25μL：10×Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，上下游引物(50pmol/μL)各 0.5μL，ddH2O 17.3μL，模板DNA 2μL，Ex Taq DNA 聚合酶(1U/μL)0.2μL；反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物純化回收，克隆至pMD18-T載體中，由北京華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 序列分析及分子進(jìn)化樹繪制 將測(cè)序結(jié)果錄入GenBank，采用Blast進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定其種類。參照GenBank中6種鉤蟲ITS1相關(guān)的基因序列(DQ381541、 DQ780009、 AM 85010、 AM 850105、DQ359149、 DQ438056、 HQ262053、 AF194145、EU344797、 GQ859497、 JQ812691、 JQ812692)， 采用Clustal X和MEGA5.1軟件計(jì)算出各序列間的遺傳距離并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 蟲卵形態(tài) 貓糞便樣品中檢測(cè)到蟲卵呈橢圓形，兩端鈍圓，大小約35μm×60μm，卵殼與卵細(xì)胞間隙明顯，含有兩個(gè)或4個(gè)卵細(xì)胞，久置后，可以觀察到卵細(xì)胞呈桑葚狀，未染色無色透明，盧戈氏碘液染色后呈棕黃色(圖1)。

圖1 錫蘭鉤蟲蟲卵(400×)Fig.1Eggs of A.ceylanicum(400×)

2.2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 采用鉤蟲屬保守引物AF和AR對(duì)蟲卵基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得約400bp的特異性片段，與預(yù)期相符(404bp)(圖2)。

圖2 貓?jiān)淬^蟲ITS1+rDNA的PCR擴(kuò)增Fig.2PCR amplification of ITS1and partial 5.8S rDNA from the cat-derived Ancylostoma sp.

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T中并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，該序列長度為404bp，包括309bp ITS1(1bp～309bp)和95bp 5.8S rDNA(310bp～404bp)，其核苷酸序列為：

2.4 測(cè)序分析 將測(cè)得的ITS1序列與GenBank中登錄的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與DQ780009.1、DQ381541.2的同源性最高，為100%，初步確定該株鉤蟲為錫蘭鉤蟲。而且采用DNAStar軟件中SepEd、MegA lign程序?qū)⑵渑c犬鉤蟲、錫蘭鉤蟲、巴西鉤蟲、十二指腸鉤蟲、狹頭鉤蟲、管型鉤蟲ITS1rDNA相關(guān)序列比對(duì)顯示，該鉤蟲的ITS1序列與印度犬源錫蘭鉤蟲的相似度為100%，與澳大利亞犬源錫蘭鉤蟲的相似度為99.7%，而與其他鉤蟲相似度均不高于97.5%，進(jìn)一步確定該鉤蟲為錫蘭鉤蟲。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 采用Clustal X和MEGA5.1軟件，以ITS1序列作為分子標(biāo)記建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，從遺傳進(jìn)化的角度確定該株鉤蟲為錫蘭鉤蟲(圖3)。

3 討 論

圖3 貓?jiān)淬^蟲ITS1以鄰接法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3Phylogenetic relationships of cat-derived Ancylostoma at the ITS1locus assessed by a neighbor-joining analysis

錫蘭鉤蟲主要流行于東南亞各國及澳洲地區(qū)，我國正位于該蟲的流行區(qū)域，周邊多國均曾報(bào)道過該蟲[4-7]，自金大雄、Yoshida等分別在貴州省和臺(tái)灣省首次報(bào)道貓錫蘭鉤蟲[8-9]至今，已有近半個(gè)世紀(jì)未見該蟲報(bào)道，最近臺(tái)灣省一例人體感染錫蘭鉤蟲的病例[10]再次提醒我們，我國并非已經(jīng)消滅了該蟲，而是一直未能發(fā)現(xiàn)。

管型鉤蟲、錫蘭鉤蟲、巴西鉤蟲是感染貓科動(dòng)物3種常見的鉤蟲。其蟲卵形態(tài)相似，顯微鏡檢測(cè)難以區(qū)分，因此鉤蟲種類鑒定的早期研究均是通過從動(dòng)物糞便或體內(nèi)獲取成蟲，依據(jù)成蟲的形態(tài)差異加以區(qū)分，但該方法耗時(shí)、耗力，對(duì)鏡檢人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，并可能造成混合感染的漏檢[8-9,11]。所以建立一種更為簡便、精確、快速的鑒別方法對(duì)于鉤蟲的分類、流行病學(xué)及地理分布研究具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員開始嘗試應(yīng)用分子技術(shù)從遺傳的角度區(qū)分不同種類鉤蟲。Gasser發(fā)現(xiàn)ITS序列可以作為區(qū)分管型鉤蟲、錫蘭鉤蟲、犬鉤蟲、狹頭鉤蟲的分子標(biāo)記[12]，Traub發(fā)現(xiàn)ITS序列可以區(qū)分犬鉤蟲、錫蘭鉤蟲、巴西鉤蟲[11]，Leandra再次證明ITS序列種內(nèi)差異小，種間差異較大，具有高度的保守性，可以作為鑒別不同種鉤蟲的分子標(biāo)記[13]。所以本研究選擇ITS1作為分子標(biāo)記，在國內(nèi)首次采用分子生物學(xué)方法鑒定貓?jiān)淬^蟲的種類，通過對(duì)該株鉤蟲ITS1的擴(kuò)增與測(cè)序，鑒定其為錫蘭鉤蟲，測(cè)序結(jié)果豐富了錫蘭鉤蟲的遺傳學(xué)信息，為錫蘭鉤蟲的分子遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。本研究在近半個(gè)世紀(jì)以后再次在我國大陸地區(qū)發(fā)現(xiàn)貓錫蘭鉤蟲，證明錫蘭鉤蟲東南亞流行區(qū)域已連成一片，對(duì)于其地理分布、種群進(jìn)化關(guān)系、種系發(fā)育研究具有重要意義。

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