劉建東，孫留克，林躍智，那 雷，王雪峰，杜 承，周建華*，曲娟娟

(1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/大動物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

14匹馬經(jīng)典MHC-Ⅰ類分子多態(tài)性分析

劉建東1,2，孫留克2，林躍智2，那 雷2，王雪峰2，杜 承2，周建華2*，曲娟娟1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/大動物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

為分析馬經(jīng)典MHC-I類分子的多態(tài)性，本研究從馬外周血單個核細胞提取總RNA，并采用RT-PCR方法對14匹馬經(jīng)典MHC-I類分子(包括編碼肽結(jié)合區(qū)的大部分區(qū)域、α3區(qū)、穿膜區(qū)以及胞漿區(qū)）進行擴增和序列分析。結(jié)果顯示，14匹實驗馬各自具有2個～4個MHC-I等位基因，其在不同馬匹之間的表達呈現(xiàn)明顯的差異性，主要分布在2個分支。盡管如此，各馬匹間均表達具有1個或1個以上相同或高度同源的對應經(jīng)典MHC-I類分子的mRNA。該研究結(jié)果為正在開展的針對馬傳染性貧血病毒減毒疫苗核心蛋白(p26）以及其他免疫原的CTL表位的篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

馬；主要組織相容性復合物；多態(tài)性；RT-PCR

主要組織相容性復合體I類分子(Major histocompatibility complex，MHC-I）是具有高度多態(tài)性的糖蛋白[1]。其編碼的分子能夠與經(jīng)抗原呈遞細胞加工處理后的抗原肽結(jié)合，成為激活相應細胞毒性T淋巴細胞的始動信號之一[2-3]。其功能是決定機體對微生物感染和移植排斥等的特異性免疫應答特性的重要因素之一[4]。經(jīng)典的MHC-I類分子的多態(tài)性不僅表現(xiàn)在預期等位基因的數(shù)量，還表現(xiàn)在附加表達不同單倍型的I類基因[5]?；蚪M發(fā)生的高頻度堿基替換是形成MHC-I類分子高度多態(tài)性的原因，也是機體對疾病正向選擇的結(jié)果[5]。馬的MHC-I基因包括啟動子區(qū)、信號肽區(qū)、α1、α2、α3區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)及3'非編碼區(qū)。其中α1和α2區(qū)編碼MHC分子肽結(jié)合區(qū)具有較高的多態(tài)性[6]。由于不同個體 MHC-I的 α1、α2、α3區(qū)呈高度多態(tài)性，對同一病原的抗原多肽親和性不同，而導致免疫應答，特別是T細胞免疫應答的差異[7]。本研究參照文獻[6]方法，利用RT-PCR技術(shù)對該區(qū)的主要序列進行擴增，對馬的經(jīng)典MHC-I類分子的多態(tài)性進行了量化分析，為馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV）的CTL表位研究提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 14匹實驗用馬均來自黑龍江省通遼，遺傳背景不明。

1.2 引物設(shè)計 引物設(shè)計參照文獻[6]報道的馬經(jīng)典MHC-I類分子擴增用特異性引物，上游引物PA：5'-GCAGGAGGGGCCGGAGTATT-3'下游引物：PB：5'-CCGTCTCACACTTTCTG-3'。引物由博仕生物技術(shù)有限公司合成，擴增目的片段長度為858 bp。

1.3 目的基因的RT-PCR擴增及測序 采用TRIzol試劑(Axygen）按產(chǎn)品說明提取馬全血總RNA。以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃30 s、72℃1 min，共30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek公司）回收后克隆至pMD18-T載體中。利用OMEGA小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后，由北京六合華大基因科技股份有限公司測序，通過DNAMAN和DNAStar進行序列比對分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 RT-PCR擴增馬MHC-I類分子 從實驗用馬分離的PBMC提取的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)特異性引物PA和PB擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示擴增片段約為850 bp，與預期目的片段的長度相符。

2.2 序列測定及分析 對每匹馬擴增的基因隨機挑選10個～20個克隆進行DNA序列測定。根據(jù)特定插入序列的有無，馬MHC-I類分子可分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩類。將所獲得的序列通過生物學軟件進行分析后顯示，在所擴增序列中未見非經(jīng)典的MHC-I類分子[8]。由于MHC-I類分子具有共顯性特征，本研究首先刪除了相互間核苷酸序列小于1%的克隆，并推測其可能的等位基因數(shù)(表1）。隨后，根據(jù)所選取的78條序列進行了多態(tài)性的比較分析。分析結(jié)果顯示，本研究中所用的14匹馬，分別具有2個～4個等位基因。進化樹分析數(shù)據(jù)顯示(圖1），14匹馬匹所獲得的序列分屬于2個大的分支。鑒于不同的MHC-I類基因?qū)乖奶岢誓芰Φ牟町?，以及等位基因的同源情況。我們推測這7匹馬可能具有相近的抗原肽提呈能力。本研究結(jié)果不但可以為正在開展的針對EIAV減毒疫苗核心蛋白(p26）的CTL表位的篩選提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，以確定EIAV弱毒疫苗免疫保護建立過程中有效的CTL表位，也是研究其他馬傳染性疾病，特別是病毒性傳染性疾病T細胞免疫應答的基礎(chǔ)之一。

表1 不同實驗馬匹等位基因表達情況Table 1 Expression of MHC-I alleles in PBMCs isolated from 14 the horses in the experiment

圖1 14匹馬共78個MHC-I分子克隆的核苷酸序列進化樹分析Fig.1 Alignment of nucleotide sequences predicted by all the 78 MHC-1 cDNA clones from 14 horses examined in this study

[1]Bjorkman,P J,Saper M A,Samraoui B,et al.Structure of the human class I histocompatibility antigen,HLA-A2[J].Nature,1987,329(6139）:506-512.

[2]Granados D P,Yahyaoui W,Laumont C M,et al.MHC I-associated peptides preferentially derive from transcripts bearing miRNA response elements[J].Blood,2012,119(26）:181-191.

[3]Zhang Y,Williams D B.Assembly of MHC class I molecules within the endoplasmic reticulum[J]Immunol Res,2006,35(1-2）:151-162.

[4]Huang A Y,Golumbek P,Ahmadzadeh M,et al.Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens[J].Science,1994,264(5161）:961-965.

[5]Tallmadge R L,Campbell J A,Miller D C,et al.Analysis of MHC class I genes across horse MHC haplotypes[J].Immunogenetics,2010,62(3）:159-172.

[6]Chung C,Leib S R,Fraser D G,et al.Novel classical MHC class I alleles identified in horses by sequencing clones of reverse transcription-PCR products[J].Eur J Immunogenet,2003,30(6）:387-396.

[7]Cadavid L F,Shufflebotham C,Ruiz F J,et al.Evolutionary instability of the major histocompatibility complex class I loci in New World primates[J].PNAS USA,1997,94(26）:14536-14541.

[8]Holmes E C,Ellis S A.Evolutionary history of MHC class I genes in the mammalian order Perissodactyla[J].J Mol Evol,1999,49(3）:316-324.

Analysis the polymorphism of classical MHC class I alleles expressed by peripheral blood mononuclear cells from 14 horses in Heilongjiang Province

LIU Jian-dong1,2,SUN Liu-ke2,LIN Yue-zhi2,NA Lei2,WANG Xue-feng2,DU Cheng2,ZHOU Jian-hua2*,QU Juan-juan1*

(1.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

In this study,cDNA sequences encoding majority region of the classical MHC class I from 14 domestic horses were amplified by RT-PCR from total RNA extracted from PBMC.The amplified fragments include coding regions for the peptide binding region(α1, α2 and α3）,the transmembrane region and the cytoplasmic domain.Results revealed that there were 2-4 MHC-I alleles in each of these 14 horses,which were consistent with the data published by other studies.In addition,the expressed MHC-I molecules of different horses were noticeable different,showing as two major branches in the phylogenetic tree.However,at least one identical or highly homology MHC-I molecule was identified among these each of these horses.These results provided essential information for the study of CTL epitope in EIAV and other immunogens.

horse;MHC;polymorphism;RT-PCR

S852.4

A

1008-0589(2013）10-0852-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.19

*Correspondingauthor

2013-04-10

國家十二五科技重大專項(2012ZX10001008-004）；國家自然科學基金(31070809）；國家自然科學青年基金(30901349）

劉建東(1986-），男，山西長治人，碩士研究生，主要從事慢病毒研究.

*通信作者：E-mail：jianhua_uc@126.com

(本文編輯：李 爽）