屈亞錦，屈秋錦，李 超，劉月月，石 迎，劉立濤，任慶海，劉思當*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018；2.山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，山東濟南250101；3.夏津縣畜牧獸醫(yī)局，山東夏津253200)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)在世界范圍內(nèi)多種禽類中流行[1]，引起雞呼吸道癥狀及產(chǎn)蛋率下降[2]，當與其他病原共感染時常導(dǎo)致雞群的高死亡率[3]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。我國自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型AIV以來，該病毒在我國雞群中廣為流行，嚴重制約了我國家禽業(yè)的健康發(fā)展。此外，國內(nèi)外有多起人感染H9N2亞型AIV的病例報道，許多血清學調(diào)查顯示我國有一定比例的人群已經(jīng)感染過H9N2病毒，血清陽性率高達13.7%～37.2%[4]。因此，對H9N2亞型AIV的監(jiān)測不僅能夠指導(dǎo)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展而且具有重要的公共衛(wèi)生意義。

血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)構(gòu)成流感病毒囊膜纖突，是流感病毒所有蛋白中最重要的一個。HA主要功能包括與宿主唾液酸細胞受體特異性結(jié)合[5]；在病毒吸附和穿膜過程中起關(guān)鍵作用；HA上裂解位點的序列直接影響AIV的致病性[6]。但HA基因變異頻率很高，抗原位點或潛在糖基化位點氨基酸的突變即可影響到病毒抗原性和致病性，受體結(jié)合區(qū)域氨基酸的變異能夠?qū)е虏《臼荏w結(jié)合性的改變，進而影響病毒感染的宿主范圍。因此，及時、準確判斷H9N2亞型AIV的變異趨勢對于有效預(yù)防該病具有重要意義。

本研究對2011年在中國北方地區(qū)家禽中分離到的11株H9N2亞型AIV擴增其HA基因，對其受體結(jié)合位點、潛在糖基化位點以及裂解位點進行比較分析，并對病毒受體結(jié)合特性進行了檢測，為我國禽流感的科學防控提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株 本實驗中11株AIVA/chicken/Shandong/091/2011(CK/SD/091/11)、A/chicken/Shandong/022/2011(CK/SD/022/11)、A/chicken/Henan/053/2011(CK/HN/053/11)、A/chicken/Liaoning/084/2011(CK/LN/084/11)、A/chicken/Shandong/0175/2011(CK/SD/0175/11)、A/chicken/Shandong/037/2011(CK/SD/037/11)、 A/chicken/Shandong/017/2011(CK/SD/017/11)、 A/chicken/Shandong/048/2011(CK/SD/048/11)、A/chicken/Hebei/099/2011(CK/HB/099/11)、A/chicken/Beijing/0110/2011(CK/BJ/0110/11)、A/chicken/Tianjin/0211/2011(CK/TJ/0211/11)由本實驗室自山東、河南、河北、北京等中國北方地區(qū)的發(fā)病雞或死亡雞中分離，并鑒定為H9N2亞型，病毒接種SPF雞胚，48h后收取雞胚尿囊液，測定血凝效價，經(jīng)細菌檢驗無污染后作為種毒貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 High Pure Viral RNA Kit、RT-PCR Kit購自 Invitrogen公司；PCR M IX、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；α-2,3唾液酸酶購自TaKaRa公司；1%雞紅細胞由本實驗室自制。

1.3 HA基因測序及分析 依據(jù)GenBank登錄的H9N2HA序列，用軟件Oligo4設(shè)計PCR引物，設(shè)計引物序列如下：HA F：GGGGAGCAAAAGCAG GGGAATTTC：HA R：GGTTATTAGTAGAAACAA GGGTGTTTTTGCCAAT，擴增長度為1620bp。按RNA提取試劑盒操作說明書，自尿液中提取病毒基因組RNA，用Unit 12：AGCAAAAGCAGG引物進行反轉(zhuǎn)錄，按常規(guī)法進行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送華大基因公司測序。

測序結(jié)果經(jīng)DNAStar 5.0軟件推導(dǎo)氨基酸序列，對裂解位點、受體結(jié)合位點及潛在糖基化位點分析，并與GenBank中登錄的國內(nèi)外H9N2AIV株的HA基因序列進行比較和分析，用MEGA4.1繪制遺傳進化樹，用Bootstrap對進化樹的可靠性進行評價，重復(fù)1000次，分析遺傳進化關(guān)系。

1.4 紅細胞法測定AIV受體結(jié)合特性 分別用自制的1%雞紅細胞，1%綿羊紅細胞和1%唾液酸酶處理過的雞紅細胞，對待測病毒進行HA試驗。其中雞紅細胞具有α-2,3及α-2,6兩種唾液酸受體；綿羊紅細胞已被證實只具有α-2,3唾液酸受體[7]；α-2,3唾液酸酶處理過的雞紅細胞只具有α-2,6唾液酸受體，通過病毒與以上幾種紅細胞結(jié)合特性的差別來判斷流感病毒的受體結(jié)合特性。

判斷標準：若病毒結(jié)合雞紅細胞及綿羊紅細胞，而不結(jié)合α-2,3唾液酸酶處理過的雞紅細胞，表明該病毒只具有α-2,3唾液酸受體結(jié)合特異性。

若病毒結(jié)合雞紅細胞(α-2,3唾液酸酶處理過的和未處理過的)，而不結(jié)合綿羊紅細胞，表明該病毒只具有α-2,6唾液酸受體特異性。

若病毒既結(jié)合雞紅細胞(α-2,3唾液酸酶處理過的和未處理過的)，又結(jié)合綿羊紅細胞，那么該病毒既具有α-2,3唾液酸受體結(jié)合特性，也具有α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性。

2 結(jié) 果

2.1 HA基因RT-PCR擴增 11株H9N2AIV提取的RNA經(jīng)Unit 12反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，以HA特異性引物進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均得到了大小約為1600bp的擴增片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DNA Marker 5000；1：空白對照；2～12：檢測樣本M:DL5000Marker;1:Negative control;2-12:RT-PCR products from AIV isolates

2.2 HA基因進化分析 從世界范圍內(nèi)分離的H9N2亞型AIV，其HA基因的系統(tǒng)進化樹分析顯示4個主要分支，分別為BJ/94-like、G1-like、Koreanlike以及Ty/66-like。我國流行的H9N2病毒主要分布在BJ/94like分支，偶爾在珍禽和人中分離到屬于G1-like分支的病毒，此次在我國北方家禽中分離到的11株家禽源H9N2病毒均屬于BJ/94-like分支，但其中一株病毒與其他10株病毒處于不同的進化分支(圖 2)。

2.3 HA基因關(guān)鍵氨基酸位點分析 流感病毒的血凝素蛋白切割位點的氨基酸序列特征是鑒定流感病毒致病力的一個重要指標。1999年之前我國流行的H9N2亞型AIV裂解位點均為PSRSSR/GLF模式，分析顯示11株H9N2病毒裂解位點的P5位均出現(xiàn)了A336S變異，變?yōu)镻-S-R-S-S-R模式，但仍保持非連續(xù)堿性氨基酸，符合低致病力AIV的序列特征(表 1)。

11株病毒中，除了CK/TJ/0211/11、CK/HB/099/11，其余9株病毒均具有8個潛在糖基化位點，值得注意的是所有病毒HA均出現(xiàn)了P295S變異，導(dǎo)致新增加了一個新的潛在糖基化位點，并且該位點靠近裂解位點，該位點是否能夠影響病毒的裂解活性或者改變病毒的抗原性尚值得深入研究(表1)。

對11株病毒的受體結(jié)合位點氨基酸分析表明，相比于我國早期的H9N2亞型AIV，近期的病毒均由Q226L變異，之前曾有研究報道Q226L變異能夠改變病毒的受體結(jié)合性，本次分離的病毒是否也出現(xiàn)受體結(jié)合性的改變將在隨后的受體結(jié)合性試驗中加以驗證。

圖111 株H9N2流感病毒的HA基因進化樹Fig.1Phylogenetic trees of the HA genes of eleven H9N2influenza viruses isolated from Northern China

2.4 紅細胞法測定病毒受體結(jié)合特性 利用只含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體的紅細胞分別與病毒結(jié)合，測定病毒的受體結(jié)合特性。如表2所示，所檢測的11株H9N2病毒與含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體的紅細胞均能結(jié)合，表明我國北方流行的家禽源H9N2病毒同時具備α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性。

3 討 論

本實驗分離的11株病毒中10株處于BJ/94-like分支，1株處于不同的進化分支，表明我國北方家禽源H9N2病毒進化方向呈多元化。本實驗表明11株H9N2病毒裂解位點均變?yōu)镻-S-R-S-S-R模式，仍符合低致病力AIV的特征，但這種裂解模式的改變是否能夠影響病毒的毒力尚值得深入研究。HA基因的潛在糖基化位點也是影響毒力的重要因素之一[8]。糖基化位點的增加或減少對病毒的抗原性以及其他生物學活性均具有一定的影響。潛在的糖基化位點可以通過兩種方式影響AIV的毒力：一是受體結(jié)合位點的糖基化會影響AIV和宿主細胞的結(jié)合水平并且會使其毒力明顯增加[9-10]。另有學者認為HA上的的糖基化位點不僅能夠增強AIV的毒力，而且還與提高AIV在雞上的適應(yīng)性密切相關(guān)[11]。另一方面裂解位點附近的糖基化位點還可能影響到蛋白酶對HA基因前體蛋白的裂解，裂解位點一旦發(fā)生糖基化作用，該病毒的毒力就可能增強[12]。本實驗所有病毒株均出現(xiàn)了P295S變異，并且該位點靠近裂解位點，這很可能會影響病毒的抗原性和裂解活性。

表1 H9N2亞型禽流感病毒HA基因關(guān)鍵氨基酸位點比對Table 1Comparison of am ino acid sequences of HA gene of representative chicken H9N2viruses

表2 紅細胞法檢測病毒受體結(jié)合類型Table 2Receptor binding specificity of the different viruses as determ ined by amodified CRBC HA assay

一般認為HA蛋白受體部位上第216位氨基酸若為亮氨酸(L)，則其識別SAα2,6Gal；若為谷氨酰胺(Q)，則識別SAα2,3Gal；若為蛋氨酸(M)，則同時識別兩種受體。本研究表明我國北方流行的家禽源H9N2AIV同時具備α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性，這種受體結(jié)合特性的改變增加了AIV感染哺乳動物的可能性，進而為產(chǎn)生禽源、哺乳動物源的新型提供了可能。

目前國內(nèi)對H9N2亞型的防控主要采用滅活苗免疫策略，但在宿主長期高免疫選擇壓力下，病毒基因會通過發(fā)生頻繁突變以逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)控，這是當前免疫失敗的主要原因。因此，有必要對我國的H9N2AIV進行持續(xù)監(jiān)測，以了解我國流行的H9N2病毒的變異情況，為指導(dǎo)禽流感疫情防控以及篩選疫苗病毒株提供依據(jù)。

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