白方方，武昱孜，劉茂軍，馮志新，熊祺琰，韋艷娜，馬慶紅，邵國青

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是一種能夠引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體。M.hyorhinis不僅在豬群中普遍存在，同時也是人類和多種動物細胞培養(yǎng)中常見的污染物。作為一種常見病原菌，M.hyorhinis通常由母豬或大豬傳染給小豬。已有研究證實能夠由10%母豬和30%～40%斷奶仔豬的鼻腔分泌物中分離出該支原體。在英國和美國的慢性豬肺炎案例中，50%以上均能夠檢測到M.hyorhinis的存在；同時在地方性肺炎暴發(fā)群中幾乎每次均能夠分離到M.hyorhinis[1]。在臺灣，研究者采用M.hyorhinis分離株ATIT-1、3、7混合物氣管內(nèi)注射可以誘發(fā)部分攻毒豬發(fā)生典型的豬支原體肺炎病變，并從大部分攻毒豬肺臟中分離到M.hyorhinis[2]。另外，已有研究證實M.hyorhinis與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)[3-4]。

迄今為止，對M.hyorhinis的檢測方法有培養(yǎng)法、血清學檢測方法等，而對M.hyorhinis檢測主要以分離培養(yǎng)為主，耗時較長，亟需建立一種敏感性高、快速、定量檢測M.hyorhinis的分子生物學檢測方法。本研究建立了M.hyorhinis實時熒光定量PCR方法，有助于快速、定量檢測M.hyorhinis的感染。

1 材料和方法

1.1 菌株 M.hyorhinis、豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)、雞毒支原體(M.gallisepticum)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV2)、豬瘟病毒(SFV)、豬流感病毒(SIV)均由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑 大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Prem ix Ex TaqTM(Perfect Real-time)、質(zhì)粒載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.3 引物和探針 根據(jù)GenBank登錄的M.hyorhinis P37序列(X14140.1)設(shè)計引物和探針(表1)。P37全基因擴增引物為P1和P2，預(yù)期擴增片段為1212bp，熒光定量PCR檢測引物為P3和P4，產(chǎn)物大小為79bp。引物和探針均由TaKaRa公司合成。

1.4 M.hyorhinis p37重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取臨床采集的疑似M.hyorhinis肺組織樣品基因組DNA，并以其為模板使用P1和P2擴增M.hyorhinis p37基因，同時以健康肺組織DNA為陰性對照。反應(yīng)條件為：94℃ 5m in；94℃ 60s、50℃ 60s、72℃100s，30個循環(huán)；72℃10m in?；厥誔CR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，對重組質(zhì)粒進行測序分析。測序結(jié)果經(jīng)序列相似性分析，確定為M.hyorhinis p37基因。

表1 引物序列Table 1Primers sequence

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 以重組質(zhì)粒為模板，采用矩陣法進行熒光定量PCR擴增，并優(yōu)化退火溫度和模板濃度、引物濃度。反應(yīng)體系為 25μL，其中 2×Premix Ex Taq 12.5μL，P3、P4各 1μL，Taq Man探針 1μL，DNA模板 1μL，校正染料Rox 1μL，去離子水補至25μL。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為95℃10min；95℃15s、53℃1min，40個循環(huán)，53℃測定熒光值。

1.6 熒光定量PCR標準曲線的建立 以M.hyorhinis p37基因陽性標準重組質(zhì)粒為標準品，分光光度計測定濃度，并計算拷貝數(shù)，分別稀釋至1.0×108拷貝 /μL～1.0×101拷貝 /μL，按照優(yōu)化的 PCR 反應(yīng)體系和程序進行擴增，經(jīng)計算機分析得出不同拷貝數(shù)的Ct值，并繪制標準曲線。

1.7 熒光定量PCR的敏感性試驗 將質(zhì)粒標準品進行 10倍倍比稀釋為 1.0×108拷貝 /μL～1.0×101拷貝/μL濃度梯度，進行熒光定量PCR檢測，確定該方法的敏感性。

1.8 熒光定量PCR的特異性試驗 分別以健康豬DNA、 M.hyorhinis、 M.hyopneumoniae、 M.gallisepticum、 M.flocculare， M.hyosynoviae， H.parasuis、A.pleuropneumoniae的基因組DNA及PCV2、SFV、SIV的核酸樣品為模板，在相同的條件下進行熒光定量PCR擴增，以檢測分子信標與目的DNA結(jié)合的特異性。

1.9 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗 以1.0×107拷貝 /μL～1.0×103拷貝 /μL質(zhì)粒標準品為模板進行熒光定量PCR分析，分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗，驗證該方法的穩(wěn)定性。

1.10臨床樣品檢測 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對江蘇地區(qū)某豬場55份臨床肺組織樣品進行檢測，并同時按照參考文獻分別利用分離培養(yǎng)法[5]和普通PCR方法[6]進行檢測，比較分離培養(yǎng)法、普通PCR和熒光定量PCR的檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以疑似陽性M.hyorhinis DNA為模板，以P1、P2為引物擴增p37基因，結(jié)果顯示，擴增出的條帶大小與預(yù)期目的片段相符(1212bp)(圖1)。回收PCR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，測定序列。將測序結(jié)果與GenBank中已知的各種微生物核苷酸序列進行相似性比對，與M.hyorhinis p37基因序列(CP002170.1)同源性達99%。表明M.hyorhinisp37基因重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 M.hyorhinis p37基因擴增Fig.1Amplification of M.hyorhinis p37gene

2.2 熒光定量PCR標準曲線的建立 以不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒DNA為模板進行熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線。以Ct值為Y軸，重組質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸繪制標準曲線，其斜率為-3.267，軸截距為 40.535，方程式為 y=-3.267x+40.535。標準曲線具有很高的相關(guān)性，R2>0.99(圖2)。

2.3 熒光定量PCR敏感性試驗 將M.hyohinis重組質(zhì)粒標準品10倍系列稀釋進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，熒光定量PCR的最低檢測限為10拷貝 /μL(圖 3)。

2.4 熒光定量PCR特異性試驗 采用熒光定量PCR方法以健康豬DNA、M.hyorhinis、M.hyopneumoniae、 M.flocculare， M.hyosynoviae， M.gallisepticum、H.parasuis、A.pleuropneumoniae的基因組DNA及PCV2、SFV、SIV的核酸樣品為模板，M.hyorhinis菌株的擴增曲線為陽性，其他樣品均為陰性(圖4)。

圖2 熒光定量PCR檢測M.hyorhinis標準品的標準曲線Fig.2Standard curve generated from positive plasm id of M.hyorhinis by real-time PCR

圖3 熒光定量PCR敏感性試驗Fig.3Sensitivity tests of real-time PCR

圖4 熒光定量PCR特異性檢測Fig.4Specificity tests of real-time PCR

2.5 重復(fù)性試驗 對 1.0×107拷貝 /μL～1.0×103拷貝/μL的質(zhì)粒DNA進行重復(fù)擴增，檢測熒光定量PCR的重復(fù)性，結(jié)果表明，Ct值變異系數(shù)均小于2%，該檢測方法具有良好的重復(fù)性(表2)。

2.6 臨床樣品的檢測 對江蘇地區(qū)某豬場55份臨床肺組織樣品進行檢測，結(jié)果顯示，建立的熒光定量PCR方法的檢出率為87.3%(48/55)，而分離培養(yǎng)方法和普通PCR方法的檢出率分別為41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。熒光定量PCR方法與分離培養(yǎng)方法及普通PCR方法相比檢出率大大提高。

表2 熒光定量PCR組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2Intra-and inter-assay of real-time PCR reproducibility

3 討 論

目前，用于M.hyorhinis的檢測方法主要包括病原學檢測、免疫學檢測及分子生物學檢測3大類。病原學檢測由組織分離病原及鏡檢，該方法費時費力，并且檢出率低。免疫學檢測方法有ELISA[7]、免疫膠體金快速檢測卡(GICAs)[8]。分子生物學方法目前有基于p37基因的原位雜交方法[9]，而國內(nèi)外尚未有對M.hyorhinis定量檢測的分子生物學方法的報道。M.hyorhinis P37蛋白能夠誘導外周血單核細胞釋放腫瘤壞死因子[10]，P37蛋白是該病原的重要特異性膜蛋白，以該蛋白基因為靶基因可以特異性檢測該病原。本研究建立的熒光定量PCR方法根據(jù)M.hyorhinis p37基因序列設(shè)計特異性引物和MGB探針，建立了M.hyorhinis熒光定量PCR檢測方法。

Makhanon等[11]比較分離培養(yǎng)方法和普通PCR方法對270份臨床肺組織樣品中M.hyorhinis的檢測，結(jié)果表明，分離培養(yǎng)法的檢出率為18.15%(49/270)，而常規(guī)單套16S rDNA PCR方法的檢出率為5.19%(14/270)。普通PCR的敏感性較低，不能滿足臨床樣品檢測的需求，而本實驗建立的Taq-Man MGB探針方法擴增的M.hyorhini片段較小，檢測的特異性大大提高。本實驗結(jié)果表明，對55份臨床樣品進行檢測，建立的熒光定量PCR方法的陽性檢出率為87.3%(48/55)，而分離培養(yǎng)方法及普通單套p37DNA PCR的陽性檢測率分別為41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。表明熒光定量PCR方法敏感性比分離培養(yǎng)方法及普通PCR方法高。試驗結(jié)果表明，本研究建立的M.hyorhinis熒光定量PCR檢測方法具有較好的特異性、敏感性及穩(wěn)定性，可以用于臨床樣品的檢測，是對M.hyorhinis分子生物學定量檢測方法的有益補充。

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