樓朝霞，梅麗娜

（湖州市婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 湖州 313000）

抑癌基因是一類細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控基因，因基因缺失、突變、重組等導(dǎo)致其正常功能失活，是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要啟動(dòng)因素，而p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因之一。野生型p53基因的蛋白產(chǎn)物能維持基因組穩(wěn)定，具有抑制或阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生，它的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用[1-2]。而突變型p53基因不僅失去了對(duì)細(xì)胞的監(jiān)視功能且本身還有促進(jìn)惡化的活性，使細(xì)胞無(wú)限制的生長(zhǎng)，是一種癌基因[3]。在宮頸癌中，野生型p53基因失活，而突變型p53基因產(chǎn)生突變型p53蛋白不能正常調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)。本研究采用PCR技術(shù)檢測(cè)宮頸癌中突變型p53基因的表達(dá)，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 材料來(lái)源 57例宮頸癌組織均取自2000年9月至2006年6月在本院行全子宮切除術(shù)標(biāo)本并經(jīng)病理組織證實(shí)為宮頸癌患者，其中鱗癌56例，占98.12%，腺癌1例，占1.18%；病理Ⅰ級(jí)8例(14.10%)、Ⅱ級(jí)22例(38.16%)、Ⅲ級(jí)27例(47.14%)。其臨床大體病理分型為：菜花型31例(60.18%)、結(jié)節(jié)型17例(33.13%)、潰瘍型3例(5.19%)。按FIGO臨床分期：Ⅱ期9例，占17.16%；Ⅲ期42例，占82.14%(因6例標(biāo)本缺乏臨床資料，不包括在臨床大體病理分型及臨床分期中)。宮頸癌患者取宮頸組織標(biāo)本前均未接受過(guò)放療和化療。正常對(duì)照15例、慢性宮頸炎15例，來(lái)源于因子宮肌瘤行全子宮切除的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 記錄患者的姓名、年齡、病程、是否經(jīng)過(guò)治療等資料。

1.2.2 基因組DNA制備 采用改良TES水浴法提取標(biāo)本組織的DNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩＞唧w方法參照參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng) (1)設(shè)計(jì)引物：根據(jù)Buchman等[5]的p53基因順序設(shè)計(jì)引物，選外顯子5、6、7、8作為研究對(duì)象，引物由上海夏華生物公司合成。(2)PCR操作：采用本室配制的體系。按94℃30 s、63℃ 45 s、72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，參數(shù)循環(huán)32個(gè)周期。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 配制2%的瓊脂糖凝膠(含1.5 μg/ml溴化乙錠)，取5 μl產(chǎn)物與1 μl溴酚蘭上樣液混勻后加樣，于1×TAE緩沖液中，70 V電泳約40 min，在紫外光下觀察擴(kuò)增條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)資料表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基因組DNA的含量及純度 宮頸癌患者基因組DNA的含量1～2 μg/g，其吸光度A260/A280值(即純度值)為(1.81±0.17)。

2.2 宮頸癌患者基因組DNA PCR擴(kuò)增的電泳圖 由圖1可見(jiàn)，2、3、5、6泳道為p53突變型，1、4泳道為p53野生型，M為AL5000DN Marker。

圖1 p53基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 突變型p53基因在宮頸正常上皮、慢性宮頸炎和宮頸癌組織中的表達(dá)率分別為：0%、40.00%和71.93%。其中宮頸癌與正常宮頸組織間陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，突變型p53基因在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于慢性宮頸炎(P＜0.05)，慢性宮頸炎與正常宮頸組織間的陽(yáng)性表達(dá)率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。突變型p53基因在低分化患者宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于中高分化組(P＜0.05)。突變型p53基因陽(yáng)性的宮頸癌患者的5年生存率明顯低于陰性的患者，見(jiàn)表1。突變型p53基因的表達(dá)陽(yáng)性率在腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表1 突變型p53基因陽(yáng)性與術(shù)后生存率的關(guān)系

表2 突變型p53基因陽(yáng)性率與宮頸癌標(biāo)本的臨床和病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是女性生殖器最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。每年新增病例約50余萬(wàn)，多發(fā)生在25～40歲，有年輕化的趨勢(shì)，而宮頸炎到癌前病變到宮頸癌有一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程，因此宮頸癌是一種可以早期預(yù)防、診斷和治愈的疾病[6]。而p53基因是與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，研究表明，50%以上的惡性腫瘤患者會(huì)有p53基因突變或缺失[7]。

人類p53基因位于染色體17q13，基因全長(zhǎng)16～20 kb，編碼393個(gè)氨基酸的磷蛋白，包含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。p53基因有野生型和突變型兩種。野生型p53基因存在于正常細(xì)胞中，是一種抑癌基因，主要具有生長(zhǎng)捕獲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。突變型p53基因則失去上述功能[8]，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，是一種癌基因。在宮頸癌中，野生型p53基因失活，而突變型p53基因產(chǎn)生突變型p53蛋白不能正常調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)。其次，與野生型p53基因功能相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)不能正常發(fā)揮功能。另外，野生型p53基因與突變型p53基因在腫瘤細(xì)胞中相結(jié)合，使野生型p53基因喪失抑癌功能也是一個(gè)重要的因素[1-3]。研究表明p53基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)的有肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等等[8-9]。從本研究資料表明，宮頸癌組織標(biāo)本中突變型p53基因的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織及慢性宮頸炎組織。在宮頸癌組織標(biāo)本中，突變型陽(yáng)性表達(dá)率臨床晚期高于臨床早期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移并且突變型p53基因陽(yáng)性的宮頸癌患者的5年生存率明顯低于陰性的患者，揭示出突變型p53基因表達(dá)情況與宮頸癌惡性程度、臨床進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究采用PCR技術(shù)，用最簡(jiǎn)單、有效、直觀的方式從不同病理分級(jí)的宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)p53的突變類型和轉(zhuǎn)錄活性，探討突變型p53基因的表達(dá)與宮頸癌惡性程度、臨床進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)于國(guó)內(nèi)宮頸癌和p53基因的研究和臨床上推廣使用具有重大意義。

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