覃國(guó)亮 馬廣耀 冼 磊 陳銘伍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

肺癌是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，NSCLC在其中又占了大多數(shù)，現(xiàn)肺癌已經(jīng)成為死亡率最高的惡性腫瘤［1］。國(guó)內(nèi)外研究表明，肺癌的發(fā)生發(fā)展與許多因素有關(guān)，其中凋亡是一個(gè)重要因素。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)中的Survivin是近年來(lái)凋亡研究的熱點(diǎn)之一。本文采用RT-PCR檢測(cè)80例NSCLC組織和60例癌旁組織中Survivin基因的表達(dá)，研究Survivin基因在NSCLC組織中的表達(dá)及其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，為肺癌的臨床診斷和綜合治療提供參考依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2007年5月至2008年10月手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本80例和距離腫瘤邊緣5 cm外的癌旁肺組織60例(部分標(biāo)本因手術(shù)切除范圍不足未納取)，其中男53例，女27例，年齡40～76(58．0±6．7)歲;按 2004年 WHO肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分類，其中鱗癌45例，腺癌35例;按分化程度分類，低分化25例，高、中分化55例;臨床分期根據(jù)1997年肺癌國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)59例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)21例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例(均經(jīng)過(guò)病理證實(shí));長(zhǎng)期吸煙47例(每天吸煙≥20支，連續(xù)20年以上)，不吸煙或少吸煙33例。所有患者術(shù)前均未接受新輔助化療或放療。研究的方案及詳細(xì)事項(xiàng)已經(jīng)在研究開(kāi)展前向患者說(shuō)明并由患者簽署同意書(shū)，本項(xiàng)研究也已經(jīng)得到廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1．2 標(biāo)本采集 腫瘤組織標(biāo)本均在標(biāo)本離體30min內(nèi)取材，腫瘤組織標(biāo)本在切取時(shí)均來(lái)源于腫瘤實(shí)質(zhì)部分，并且盡可能避開(kāi)壞死組織，距離腫瘤邊緣5cm外癌旁肺組織標(biāo)本取材方法同腫瘤標(biāo)本，然后焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水清洗雜質(zhì)及血凝塊，無(wú)菌紗布沾干水分后保存在液氮罐中，并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱采用新鮮冰凍的方式保存直到研究開(kāi)展。

1．3 RT-PCR法 使用Trizol法提取標(biāo)本的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠將提取后的總RNA電泳并使用凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)觀察結(jié)果。結(jié)果參考標(biāo)準(zhǔn):如果有28S、18S及5S三條帶出現(xiàn)，并且28S條帶的亮度是18S條帶亮度的兩倍，說(shuō)明總RNA并未出現(xiàn)降解，其相對(duì)分子量分布正常。通過(guò)以上標(biāo)準(zhǔn)篩選符合實(shí)驗(yàn)條件的總RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Fermentas公司的RevertAidTMFirstStrandcDNA，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA及時(shí)使用或存放于－20℃環(huán)境下備用。設(shè)計(jì)引物后由上海捷瑞公司合成所需檢測(cè)的基因及內(nèi)參引物。Survivin目的基因序列:Forward5'-GGAAGGGTTGTGAATGA-3';Reverse5'-TTGGCTTGCTGGTCTC-3'。β-actin基因作為內(nèi)參:

Forward5'-CTCGCGTACTCTCTCTTTCTGG-3';

Reverse5'-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3'。PCR反應(yīng)體系為25μL:其中模板1μL，上、下游引物各1 μL，TakaraPremixExTaqVersion2．0(Loadingdye Mix)12μL，最后 ddH2O10μL補(bǔ)足25μL反應(yīng)體系。94℃預(yù)變性 4min，94℃變性 45s，56℃退火 45s，72℃延伸45s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，4℃下凝膠電泳觀察結(jié)果或4℃進(jìn)行保存。

1．4 觀察指標(biāo) 將6μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物在滴加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠(濃度2%)中均勻加樣，電泳緩沖液為0．5×TBE，β-actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行檢驗(yàn)，并同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，通過(guò)30min的120V恒壓電泳后，將凝膠放入Bio-RadGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)，判斷標(biāo)本中有無(wú)擴(kuò)增所需基因的特異性片段，在標(biāo)本對(duì)應(yīng)內(nèi)參正常時(shí)，出現(xiàn)目的基因條帶的表示此基因陽(yáng)性表達(dá)，沒(méi)有出現(xiàn)的則為陰性表達(dá)，電腦拍照并記錄。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher精確檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Survivin基因電泳 應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織的Survivin基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果獲得片段為 131bp，內(nèi)參片段為 334bp，見(jiàn)圖1。80例NSCLC及60例癌旁組織中Survivin基因的表達(dá)水平分別為 67．75%(55/80)和 41．67%(25/60)。肺癌組織中Survivin基因表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10．269 ，P=0．001)。見(jiàn)表1。

圖1 SurvivinRT-PCR瓊脂糖電泳圖

表1 非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁肺組織中Survivin基因表達(dá)情況

2．2 Survivin表達(dá)與臨床、病理等特征的關(guān)系 肺癌組織中Survivin基因表達(dá)與肺癌患者性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、病理類型和分化程度均無(wú)關(guān)(P＞0．05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0．05)。見(jiàn)表2。

表2 Survivin表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。愈來(lái)愈多的研究表明肺癌的發(fā)生與發(fā)展與細(xì)胞增殖異常以及凋亡平衡失調(diào)有關(guān)，平衡的破壞為存在基因缺陷的細(xì)胞提供生存空間，促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

1997年耶魯大學(xué)的Altier用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)在人類基因組庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因，命名為Survivin［3］。Survivin定位于17q25，基因長(zhǎng)約15kp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，其編碼產(chǎn)物是由142個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量16．2 KD。Survivin基因可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。其具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能［4］。

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白特異地表達(dá)于細(xì)胞周期G2/M期，G1期檢測(cè)不到，他主要通過(guò)級(jí)聯(lián)式激活并溶解蛋白質(zhì)，這表明Survivin是一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因［5］。他一方面直接或間接地抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白caspase的活化從而阻止細(xì)胞凋亡;另一方面通過(guò)與紡錘體纖維結(jié)合，間接抑制caspase對(duì)紡錘體的水解，保護(hù)有絲分裂的完整性，從而抑制細(xì)胞的凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中Survivin在肺癌組織中表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，根據(jù)這個(gè)特性對(duì)判斷肺癌的預(yù)后有重要的意義。Survivin蛋白過(guò)度表達(dá)通常提示對(duì)放、化療的敏感性較低，預(yù)后較差;應(yīng)用RNA干擾Survivin蛋白的表達(dá)可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可提高腫瘤對(duì)放、化療的敏感性［6］。提示Survivin基因可能將是治療NSCLC的一個(gè)新靶點(diǎn)。

本研究中Survivin在NSCLC中表達(dá)率達(dá)67．75%，高于癌旁組織中41．67%的表達(dá)(P＜0．05)，其表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、病理類型、分化程度無(wú)關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以及臨床分期有關(guān)，與國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道一致［7～9］。Survivin基因在肺癌組織中高表達(dá)，說(shuō)明他可能通過(guò)抑制癌細(xì)胞凋亡而對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。Survivin基因表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有一定相關(guān)性，病人臨床分期越晚，局部晚期的表現(xiàn)越明顯(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，則Survivin基因陽(yáng)性表達(dá)率也越高，這表明Survivin基因的陽(yáng)性表達(dá)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，越晚期的肺癌患者的標(biāo)本中越有可能檢測(cè)到Survivin基因陽(yáng)性表達(dá)。

大量的研究證明，Survivin基因可作為腫瘤的特異性生物學(xué)標(biāo)記物，其不僅為非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷提供可靠的依據(jù)，還是基因治療的目的基因。目前研究Survivin基因在肺癌中的治療主要有以下幾個(gè)方面:①針對(duì)Survivin基因的反義寡核苷酸來(lái)抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的［10］;② Survivin反義核酸的表達(dá)能夠快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡．同時(shí)伴有靶細(xì)胞增殖的下降［11］;③Survivin基因與腫瘤血管生成有密切關(guān)系，抑制Survivin基因有可能可以抑制腫瘤血管生成［12］。隨著對(duì)Survivin研究的深入，其有望成為新的腫瘤診斷標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)，為肺癌的診斷和治療帶來(lái)希望。

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