饒燕飛 ，鄒湉 ，楊桂玲 ，王小中 ，丁偉榮

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江西省血液病研究所，江西 南昌 330006；3、江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

慢性粒細(xì)胞白血病 (chronic myelocytic leukemia，CML)是一種克隆性骨髓增殖異常性疾病，其特征是存在特異性Ph1染色體，形成bcr-abl融合基因，編碼異常的融合蛋白P210，P210具有酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致CML發(fā)生。迄今治愈CML的最有效方法是異基因造血干細(xì)胞移植(allogenenic stem cell transplantation，Allo-SCT)，然而由于受干細(xì)胞來源及患者年齡等諸多因素限制，僅有少部分患者能進(jìn)行該方法治療。目前，人們?cè)絹碓街匾暶庖咧委?，特別是T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫效應(yīng)在CML治療中的作用。異基因T細(xì)胞對(duì)Allo-SCT后CML復(fù)發(fā)能產(chǎn)生強(qiáng)力的保護(hù)作用；給Allo-SCT后CML復(fù)發(fā)患者輸注同一供者的淋巴細(xì)胞，可誘導(dǎo)疾病的再次緩解，這是細(xì)胞免疫介導(dǎo)的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)作用的最直接證據(jù)，誘導(dǎo)和提高特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)是根治CML的方向之一。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，CML細(xì)胞體外誘導(dǎo)可生成樹突狀細(xì)胞(DC)，稱之為慢性粒細(xì)胞白血病-樹突狀細(xì)胞(CML-DC)。由于這種DC來源于白血病細(xì)胞，自身帶有白血病抗原，而且又是抗原提呈細(xì)胞(APC)，因來自患者本身，不存在組織相容性復(fù)合物(MHC)限制，若其免疫功能得到肯定，它就有可能在白血病免疫治療方面開辟嶄新的領(lǐng)域。但有研究表明，未成熟白血病源性DC胞飲能力低以及成熟白血病源性DC功能有一定缺陷，其表面的CD80、CD83、CD86、MHCⅠ類和 MHCⅡ類分子表達(dá)減少[1]。本研究體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CML-DC，觀察其形態(tài)、免疫表型、白血病源性及其所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。同時(shí)研究觀察人CML總RNA體外轉(zhuǎn)染對(duì)CML-DC抗原遞呈功能的影響，以探討RNA抗原負(fù)載DC疫苗體外制備的有效性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于我院2006年2月至2007年8月初治未經(jīng)化療CML患者14例 (慢性期)，男9例，女 5例。年齡22～70歲。Ph1染色體和bcr-abl融合基因均陽(yáng)性。診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)[2]。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；DMSO購(gòu)自上海華美生物工程公司；重組人粒單核細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素 4(rhIL-4)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)均購(gòu)于Peprotech公司；CD83、CD1α單抗購(gòu)于Caltag公司。Trizol試劑、鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (MMLV)購(gòu)自Gibco/BRL公司。Tag DNA聚合酶購(gòu)自Sangon公司。

1.3 方法

1.3.1 慢性粒細(xì)胞白血病來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[3]，無菌采集CML患者骨髓液5ml，肝素抗凝，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后，取界面層的單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用PBS洗滌3次，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，加入6孔板，每孔3ml，每孔 中 加 入 GM-CSF 100ng/ml，IL-4 100ng/ml， 于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4d半量換液及添加細(xì)胞因子，并用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及攝片。培養(yǎng)第7d，每孔第7d加入TNF-α10ng/ml，第14d收集細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。培養(yǎng)液中不添加細(xì)胞因子、培養(yǎng)相同數(shù)量和時(shí)間的AML-MNC作為對(duì)照。將培養(yǎng)前后細(xì)胞送流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD1a、CD83表達(dá)率。

1.3.2 免疫表型檢測(cè) 取培養(yǎng)14d后的細(xì)胞懸液，用PBS洗滌液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，分別加入鼠抗人單抗CD83-FITC和CD1α-PE標(biāo)記30min，洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率，用EPICSXL systemⅡ軟件分析。以同型IgG-FITC作陰性對(duì)照。

1.3.3 慢性粒細(xì)胞白血病來源的樹突狀細(xì)胞Ph1染色體檢查 將培養(yǎng)成熟的CML-DC經(jīng)秋水仙堿處理停滯于細(xì)胞分裂中期，收集細(xì)胞后經(jīng)預(yù)固定、第一、二次固定后置于冰處理玻片上制片，75~80℃2h，以 37℃、pH7.0~7.2，0.25%的胰蛋白酶溶液消化大約10min，以10%Giemsa液染色15~20min，自來水漂洗待干后鏡檢與照相。

1.3.4 CML成熟樹突狀細(xì)胞bcr-abl融合基因的巢式RT-PCR檢測(cè) 按照Trizol說明書將CML-DCs抽提出總RNA，以核酸蛋白分析儀測(cè)得總RNA的濃 度 及 A260、A280數(shù) 值 ，AMV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。第1輪PCR引物：A：5’-CTC CAG ACT GTC CAC AGC ATT CCG-3’；B:5’-CAG ACC CTG AGG CTC AAA GTC AGA-3’；第 2輪 PCR 引物：C:5’-GCT TCT CCC TGA CAT CAT CCG TG-3’； D:5’-CGA GCG GCT TCA CTC AGA CC-3’。94℃5min 變性，94℃45s，55℃60s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)，70℃延伸7min。內(nèi)參照基因?yàn)棣耡ctin基因，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度528bp。取第2輪PCR產(chǎn)物及Marker各5μl，在100V電壓條件下電泳約30min，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，拍照和分析結(jié)果。

1.3.5 慢性粒細(xì)胞白血病總RNA轉(zhuǎn)染CML-DC DCs培養(yǎng)第5d，于轉(zhuǎn)染前2h，使用無血清培養(yǎng)基RPMI1640洗細(xì)胞3次，以無血清培養(yǎng)基調(diào)至1×106/ml待用，并分為三組：實(shí)驗(yàn)1組，按照操作說明書將CML細(xì)胞總RNA和脂質(zhì)體的混和物加至DC培養(yǎng)板，比例為10μg總RNA/106DCs，并在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，4h后吸出上清，按照DC培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)，記為總RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CMLDC組；實(shí)驗(yàn)2組，將CML細(xì)胞總RNA直接加至DC培養(yǎng)板， 比例為 10μg總 RNA/106DCs，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，4h后吸出上清，按照DC培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)，記為裸總RNA轉(zhuǎn)染 CMLDC組；實(shí)驗(yàn)3組，加入脂質(zhì)體至DC培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)DC，記為單純CML-DC組。共獲得三種CML-DC細(xì)胞，用于下面的MTT法測(cè)定CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果試驗(yàn)。

1.3.6 MTT法測(cè)定CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果抽取患者外周血5ml，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液提取出MNC，以1×107/ml密度種入培養(yǎng)瓶，2h貼壁后選取懸浮細(xì)胞，以5×106/ml種入培養(yǎng)瓶，加入IL-2(終濃度為100ng/ml)，隔天換液，培養(yǎng)至第7d分別與上述三種成熟CML-DC按照3：1的比例混合，以IL-2 100ng/ml，隔天換液繼續(xù)培養(yǎng)7d，分離去除CML-DC細(xì)胞，獲得三種CTL效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)照組為單純IL-2培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞。另取液氮保存的CML BMMNC加培養(yǎng)液、自體血清和rhGM-CSF，在37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)72h，以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為靶細(xì)胞。按效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞20：1加入96孔培養(yǎng)板，效應(yīng)細(xì)胞孔每孔加入1×106個(gè)淋巴細(xì)胞，靶細(xì)胞孔每孔加入5×104個(gè)靶細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)一組孔只加培養(yǎng)液作為對(duì)照，作用 24h后，每孔加入 MTT20μl，在 37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)4h，離心，去除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO，振蕩使結(jié)晶物溶解，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為570nm下讀取A值。重復(fù)3次。計(jì)算公式如下：CTL活性 (%)＝(靶細(xì)胞孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值+效應(yīng)細(xì)胞孔A值)/靶細(xì)胞孔A值×100%。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料用x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，使用SPSS13.0軟件分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的CML-DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變觀察 剛分離的細(xì)胞表面光滑，大小均勻的球形細(xì)胞；第3d開始見細(xì)胞增殖成簇，聚團(tuán)生長(zhǎng)，懸浮狀，細(xì)胞表面出現(xiàn)少量小突；培養(yǎng)至第8d(加入TNF-α后1d)，細(xì)胞表面很快出現(xiàn)較多具有毛刺形狀，形態(tài)不規(guī)則的DC；培養(yǎng)至第14d，細(xì)胞具有大量毛刺，呈半懸浮狀態(tài)，成為具有典型形態(tài)的DC。

2.2 CML-DC培養(yǎng)前后免疫表型的變化 培養(yǎng)前CML骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD1a、CD83表達(dá)率分別為4.22±1.03%、1.44±0.94%，培養(yǎng)后成熟 CML-DC 表達(dá)率明顯增高，分別為 20.13±3.43%、26.76±2.79%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 成熟樹突狀細(xì)胞CML源性檢測(cè) CML BMMNC誘導(dǎo)出的DC經(jīng)G顯帶分析均具有t(9;22)染色體易位，即Ph1染色體。并且經(jīng)巢式RT-PCR檢測(cè)可見165bp和90bp兩種片斷。而bcr-abl融合基因有b3a2和b2a2兩種形式，其中b3a2表達(dá)產(chǎn)物為165bp，b2a2表達(dá)產(chǎn)物為90bp，因此可見兩種片斷，也證明了樹突狀細(xì)胞的白血病源性。見圖1。

圖1 慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)出的樹突狀細(xì)胞bcr-abl融合基因檢測(cè)結(jié)果。

2.5 慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA的的質(zhì)量檢測(cè) 1×107個(gè)腫瘤細(xì)胞，經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，可獲得80～120μg總RNA，經(jīng)凝膠電泳，可見18S、28S兩條清楚的帶，證明總RNA未降解。測(cè)得A260/A280的比值均在1.8~2.0之間，說明提取的RNA純度較好。

2.6 MTT法測(cè)定CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果實(shí)驗(yàn)各組DC按照3：1的比例與T淋巴細(xì)胞混合，生成的CTL活性測(cè)定結(jié)果顯示：總RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CML-DC組、裸總RNA轉(zhuǎn)染CML-DC組和單純DC組的CTL在效：靶比為20：1時(shí)，對(duì)CML骨髓單個(gè)核細(xì)胞的殺傷效率分別為75.33±3.11%、37.23±2.92%、29.62±1.61%， 均明顯高于對(duì)照組(9.87±3.43%，P<0.01)。總 RNA 脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染的CML-DC組的CTL殺傷活性最強(qiáng)，與其他三組殺傷活性均有顯著性差異(P<0.001)。單純DC的CTL組明顯高于經(jīng)IL-2培養(yǎng)的對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

近年來，人們對(duì)CML免疫治療越來越感興趣，由于CML同時(shí)具備誘發(fā)主動(dòng)免疫的兩大特性，即既具備腫瘤特異性抗原P210蛋白，又具備自身被誘導(dǎo)成DC。 CML克隆起源的DC，利用自身高表達(dá)MHC分子，共刺激分子及黏附分子，可將雙刺激信號(hào)傳遞給T細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性CTL，故在免疫效應(yīng)發(fā)揮作用[4]。為了解CML-DC的生物學(xué)特性，本研究體外誘導(dǎo)培養(yǎng)CML-DC，并探討人CML總RNA體外轉(zhuǎn)染對(duì)CML-DC抗原遞呈功能的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的培養(yǎng)DC的細(xì)胞因子組合GM-CSF＋I(xiàn)L-4＋TNF-α 將 CML-BMMNC 誘生成大量具有毛刺形狀DC。我們檢測(cè)CML-DC經(jīng)誘導(dǎo)分化前后的表型變化，結(jié)果顯示剛分離的CML細(xì)胞CD1α、CD83陽(yáng)性細(xì)胞小于5%，體外誘導(dǎo)14d后，CD1α、CD83 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 分 別 占 21.13±3.45% 、25.76±2.78%。 CD1α、CD83是成熟 DC 的表面標(biāo)記，證明了CML-BMMNC可誘導(dǎo)成熟的DC。同時(shí)，我們應(yīng)用了染色體G顯帶技術(shù)及巢式RT-PCR技術(shù)對(duì)CML-DC進(jìn)行了檢測(cè)，均具有Ph1染色體及bcr-abl融合基因存在，證明了CML-DC具有白血病源性。

白血病DC疫苗系體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的DC用各種方式負(fù)載上白血病抗原然后回輸患者體內(nèi)的一種免疫治療策略。但每種抗原負(fù)載方式產(chǎn)生的CTL作用不同，且各有其優(yōu)缺點(diǎn)[5-7]。DNA負(fù)載DC雖然最能誘導(dǎo)特異性的CTL反應(yīng)，但RNA負(fù)載的DC也能產(chǎn)生較特異性的CTL作用，可以誘導(dǎo)針對(duì)不同表位的多克隆CD8＋CTL和CD4＋CTL，具有以下優(yōu)點(diǎn)：疫苗相對(duì)安全，RNA半壽期短，不會(huì)整合到基因中，不要求對(duì)腫瘤抗原作出鑒定，而且陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染載體的技術(shù)也比較成熟[8-10]。綜合考慮以上因素，為誘導(dǎo)更特異性的抗白血病CTL免疫反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)以CML細(xì)胞的總RNA負(fù)載CML-DC。本實(shí)驗(yàn)采用10μg總RNA/106DC的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，達(dá)到了RNA成功轉(zhuǎn)染的目的。提示CML總RNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CML-DC的可行性和高效性。而以裸總RNA直接轉(zhuǎn)染CML-DC，所誘導(dǎo)的CTL明顯低于經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的CML-DC所誘導(dǎo)的CTL，略高于單純CML-DC所誘導(dǎo)的CTL。結(jié)果說明，用裸RNA轉(zhuǎn)染DC，雖然避免了脂質(zhì)體對(duì)DC的毒性，但因沒有載體介導(dǎo)，且RNA自身又易降解，因此轉(zhuǎn)染效率低下。

綜上所述，慢性粒細(xì)胞白血病的骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后可以生成CML-DC，具有DC典型的形態(tài)和功能，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞總RNA可以提高CML-DC的抗原遞呈功能，介導(dǎo)更強(qiáng)的抗自身CML細(xì)胞的特異性免疫殺傷作用。

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