楊天天，王曉平，楊成君，尉建平，李 波，王 軍

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，北京 1000085)

山葡萄是中國重要的野生果樹資源，具有極強(qiáng)的抗寒性，是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料［1］。果實(shí)色澤是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，尤其對(duì)于紅色釀酒葡萄品種。果實(shí)的顏色決定了葡萄酒的色澤和品質(zhì)，而花色苷又是決定果實(shí)著色的主要物質(zhì)，分布于果皮、果肉和葡萄籽等處，其中，果皮含量最高［2］。轉(zhuǎn)色期作為非躍變型果實(shí)特有的一個(gè)生長(zhǎng)階段，是漿果在大小、硬度、色澤以及內(nèi)部生理特點(diǎn)發(fā)生劇烈變化的時(shí)期［3］。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)也稱反式作用因子，是指能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用原件發(fā)生特異性結(jié)合，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白質(zhì)元件的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間下表達(dá)蛋白質(zhì)分子。在植物生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［4］。在葡萄中，對(duì)MYB基因功能的研究主要集中在通過控制類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)調(diào)控花青素的生物合成，MYB5a、MYB5b、MYBPA1 和MYBPA2都參與了類黃酮的代謝［5-10］，葡萄全基因組108個(gè)R2R3 MYB基因已公開發(fā)表［11］。

本研究擬從山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫中分離得到一段與轉(zhuǎn)錄因子MYB相關(guān)的基因片段，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為闡明山葡萄花色苷的生物合成及調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山葡萄品種雙豐(Vitis amurensis cv.Shuang Feng)采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所國家山葡萄種質(zhì)資源圃。在果實(shí)轉(zhuǎn)色期(50%著色)采摘，采后洗凈擦干，立即置于液氮中冷凍，于-80℃冰箱保存，取果皮作為供試材料。

大腸桿菌(E.coli)DH5α、pMD18-T 載體、膠回收試劑盒、Ex Taq聚合酶、PrimeScriptTMRT REAGENT Kit均購自TaKaRa，其他試劑為國產(chǎn)分析純。DNA測(cè)序由北京華大生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、純化和cDNA合成 采用改良的 CTAB法［5］提取總 RNA，并進(jìn)行純化，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent試劑盒說明書合成cDNA，保持環(huán)境低溫。

1.2.2 RT-PCR合成目的基因片段 首先構(gòu)建山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫，并進(jìn)行EST測(cè)序和生物信息學(xué)分析。從中選取一條與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因片段(02_H07)，使用BlastN程序?qū)⑵湓贜CBI上進(jìn)行同源基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與葡萄雜交種Colobel、Vintinto的轉(zhuǎn)錄因子 MYBA3基因相似性達(dá)到98%，與歐亞種葡萄VvmybA1相似性達(dá)97%，與歐亞種和美洲種的雜交品種的VlmybA1-1和VlmybA1-2的相似性分別為97%和96%。由搜索結(jié)果可以看出，MYB類基因保守區(qū)和兩端非編碼區(qū)的序列相似性極高，因此可以選取一個(gè)相似性最高的品種，根據(jù)其全長(zhǎng)序列在兩端分別設(shè)計(jì)特異引物。本研究利用Primer 5.0設(shè)計(jì)了3對(duì)特異引物，相關(guān)引物名稱、引物序列和退火溫度等信息見表1。

表1 合成目的基因片段的引物序列Table 1 Primer used for amplifying target gene fragments

3個(gè)PCR管分別標(biāo)記為A、B、C。將已獲得cDNA作為模板，利用特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系及條件:10× Ex Taq Buffer 2.0 μl，引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.6 μl，MgCl2(2.5 mmol/L)1.2 μl，TaKaRa Ex Taq酶(5 U/μl)0.5 μl，模板 cDNA(20 ng/μl)2.0 μl，ddH2O 10.7 μl。94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72℃延伸X，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。延伸時(shí)間X根據(jù)預(yù)期PCR片段確定，1000 bp以內(nèi)為90 s，每超過500 bp延長(zhǎng)30 s。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，于凝膠成像系統(tǒng)下成像觀測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的DNA片段回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書(購自上海寶生物公司)對(duì)PCR產(chǎn)物的DNA片段進(jìn)行回收、連接與轉(zhuǎn)化。對(duì)片段進(jìn)行切割時(shí)，要盡可能減少DNA片段的損失，也要盡可能避免在紫外燈下照射過長(zhǎng)時(shí)間。將回收的DNA片段與載體pMD-18連接，16℃連接過夜。反應(yīng)體系為 10.0 μl，其中 DNA 片段 4.5 μl、pMD-18載體 0.5 μl、Ligation Mix 5.0 μl。

1.2.4 轉(zhuǎn)化 將50 μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞在冰上解凍后加入5 μl連接產(chǎn)物，加入預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，取適量菌液，涂布于含有50 μg/μl的氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板上，過夜。次日，挑菌并置于37℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)6～8 h。隨后進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系和程序同前。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)是否有相應(yīng)大小的條帶，隨后將菌液送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，剩余菌液加入適量甘油置于-80℃保存。

1.2.5 目的基因的序列分析 對(duì)測(cè)序后的目的基因片段應(yīng)用Vector NTI Suite 9.0軟件去除載體序列后拼接獲得cDNA全長(zhǎng)，應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)獲得的目的基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框分析，并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。利用BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)程序在 NCBI上進(jìn)行氨基酸相似性比對(duì)分析，應(yīng)用pfam24.0(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)對(duì)該基因進(jìn)行家族預(yù)測(cè)。運(yùn)用Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及基本性質(zhì)。信號(hào)肽分析利用Signalp 3.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signalp)?？缒^(qū)預(yù)測(cè)利用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。疏水性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別在http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl和http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPS/npsa_hnn.html網(wǎng)站進(jìn)行。應(yīng)用ClustalX 2.1對(duì)不同植物相關(guān)基因氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)，利用MEGA 4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

采用改良CTAB法提取山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮總RNA，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，點(diǎn)樣孔處沒有亮帶，且條帶兩側(cè)沒有明顯的彌散，亮度接近于2∶1，表明總RNA沒有降解，較完整。總RNA的純度使用核酸測(cè)定儀測(cè)定，紫外吸收值OD260/OD280為1.99，OD260/OD230為2.14，表明 RNA均一性較好，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 山葡萄總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from Vitis amuerensis

2.2 全長(zhǎng)序列克隆

以提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用3對(duì)特異引物AF/AR、BF/BR、CF/CR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有特異引物BF/BR獲得了目的基因特異條帶，電泳結(jié)果如圖2所示，對(duì)750 bp左右的目的片段，進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化。在目的片段轉(zhuǎn)化平板后，隨機(jī)挑取單克隆，加入含有氨芐青霉素(Amp)50 μg/μl的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖3所示，獲得長(zhǎng)約750 bp的基因片段。

圖2 山葡萄MYBA3基因cDNA片段電泳檢測(cè)Fig.2 Agarose gel electrophoresis of cDNA fragment of Vitis amuerensis MYBA3 gene

2.3 全長(zhǎng)序列分析

菌液測(cè)序委托北京六合華大基因科技股份有限公司。將獲得的測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Vector NTI Suite 9.0軟件去除載體序列，然后拼接獲得一段目的基因片段，通過BLAST程序在NCBI上進(jìn)行同源搜索比對(duì)，結(jié)果顯示該片段為山葡萄MYBA3的全長(zhǎng)片段。應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行cDNA序列開放閱讀框的分析并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)果顯示，該基因全長(zhǎng)764 bp，包括開放閱讀框753 bp和11 bp的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)。推測(cè)基因的開放閱讀框編碼250個(gè)氨基酸，分子量為 28680，等電點(diǎn)為7.49。負(fù)電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為35個(gè)，正電荷(Asp+Glu)數(shù)為35個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為37.69，系穩(wěn)定蛋白質(zhì)。開放閱讀框推導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸序列如圖4所示。

圖3 山葡萄MYBA3基因插入片段的PCR檢測(cè)Fig.3 PCR detection of MYBA3 inserts of Vitis amuerensis

圖4 山葡萄MYBA3基因序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MYBA3 gene from Vitis amuerensis

利用NCBI的BlastP在線比對(duì)軟件，在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(Conserved domin database，CDD)，對(duì)山葡萄基因 MYBA3推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)預(yù)測(cè)。結(jié)果(圖5)表明，該基因具有兩個(gè)保守區(qū)，屬于SANT超基因家族，從第8個(gè)氨基酸到第55個(gè)氨基酸和從第61個(gè)氨基酸到第106個(gè)氨基酸，分別匹配48個(gè)和46個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。

應(yīng)用ProScale在線軟件，以默認(rèn)算法(Hphob.Kyte＆Doolittle)對(duì)該基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖6)顯示，蛋白質(zhì)疏水性最大值為1.367，最小值為-3.100，疏水平均值為-0.867，具有一定的親水性。用TMHMM-2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖7所示，推測(cè)該蛋白質(zhì)可能不具有跨膜區(qū)，主要是在膜外進(jìn)行作用。信號(hào)肽分析表明該蛋白不具有信號(hào)肽。二級(jí)結(jié)構(gòu)則主要是以α-螺旋和不規(guī)則盤繞為蛋白質(zhì)最大量的結(jié)構(gòu)原件。

圖5 推導(dǎo)的氨基酸序列的保守區(qū)預(yù)測(cè)Fig.5 Search for conserved domains in deduced sequence of amino acid

圖6 蛋白疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity profiles of the protein

圖7 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of transmembrane domain

用推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的調(diào)節(jié)基因的編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見圖8。其中，山葡萄氨基酸序列與歐亞種葡萄、葡萄雜交種、煙草、牽牛花、酸櫻桃、楊梅、朝天椒和甜杏仁的氨基酸序列相似系數(shù)分別為97%、98%、55%、55%、53%、51%、45%和49%。

用MEGA 4軟件對(duì)該基因及其他植物調(diào)節(jié)基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，繪制分子進(jìn)化樹(圖9)。結(jié)果表明，山葡萄轉(zhuǎn)錄因子MYBA3基因與同種屬的歐亞種葡萄(V.vinifera)、葡萄雜交種(V.hybrida cultivar)轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系最近，與其他物種如楊梅(M.rubra)、朝天椒(C.annuum)、酸櫻桃(P.cerasus)、煙草(N.tabacum)、甜杏仁(P.dulcis)的調(diào)節(jié)基因的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)。

3 討論

以cDNA文庫為信息來源，從中分離并克隆到山葡萄花色苷生物合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子MYBA3基因，并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)序列為764 bp，編碼250個(gè)氨基酸，與歐亞種葡萄(V.vinifera)相關(guān)基因的序列相似性達(dá)到了97%，與葡萄雜交種(V.hybrida)相似性達(dá)到了98%。氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析說明，MYBA3基因與歐亞種葡萄和葡萄雜交種MYBA3基因同源性較高。該基因不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，而具有一定的親水性，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為蛋白質(zhì)最大量的結(jié)構(gòu)元件。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因控制花色苷生物合成過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)，影響花色苷生物合成的強(qiáng)度和模式［12］。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)各種生理代謝反應(yīng)的關(guān)鍵因子，具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)和MYB區(qū)，它們高度保守的DNA結(jié)合域使得利用PCR方法分離克隆MYB基因家族成員成為可能。MYB基因的分離克隆可以為研究者提供這類轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)植物某些生理過程調(diào)控機(jī)制的相關(guān)信息［13］。MYB蛋白家族功能復(fù)雜多樣，對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育及生理代謝中的調(diào)控機(jī)理的深入研究和解析，尚有賴于大量MYB轉(zhuǎn)錄因子基因及相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析的驗(yàn)證。

圖8 MYBA3基因推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.8 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of MYBA3 gene

圖9 由MYBA3基因推導(dǎo)的氨基酸構(gòu)建的分子進(jìn)化樹Fig.9 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of MYBA3 gene

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