劉 莉， 林嘉鵬， 吳陽升， 汪立芹， 田永芝， 黃俊成

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術(shù)重點開放實驗室，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室，新疆 烏魯木齊 830000)

將DNA或者RNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中是生物化學(xué)和分子生物學(xué)目前主要的技術(shù)，導(dǎo)入的外源遺傳物質(zhì)會引起蛋白質(zhì)合成抑制或者是基因沉默。單獨的核酸物質(zhì)是不能夠穿過細(xì)胞壁的，所以需要有效的載體來運輸［1］。常見運輸載體有病毒、脂質(zhì)體和聚合物等，盡管大多數(shù)有關(guān)研究都注重于用病毒介導(dǎo)的方法將基因于體外和體內(nèi)送遞進(jìn)入細(xì)胞，然而非病毒基因載體由于其安全性高、易于制備和工藝放大、不會引起特異的免疫應(yīng)答等優(yōu)點而備受青睞。

Mg2Al-Cl-LDH是一種新型的潛在的投遞外源基因的載體。最近的研究結(jié)果表明，由于LDH納米顆粒具有獨特的化學(xué)性質(zhì)，所以具備一些獨特的優(yōu)勢。首先一個明顯的優(yōu)勢就是它具有可調(diào)節(jié)的陰離子夾層結(jié)構(gòu)，使其具有強負(fù)載能力把具有生物活性的物質(zhì)比如核酸分子插入其中［2］;其次它表面帶正電，能夠明顯地與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的基團(tuán)發(fā)生吸附并跨過細(xì)胞膜;再次它具有單一的化學(xué)成分，所以顯示出低細(xì)胞毒素和高生物相溶性［3］。

Xu等［4］用LDH與pEF-eGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的7% ～15%。Ladewig等［5］用 Mg2Al(OH)6NO3LDH 納米顆粒材料與質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染HEK293T、NIH3T3、COS-7和CHO-K1等貼壁細(xì)胞系，但無法轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的CHO-S細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)制備LDH復(fù)合溶液條件的改變會影響納米粒子在懸濁液中的分散度。本研究利用合成的LDH懸濁液與pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，設(shè)計不同LDH濃度和不同轉(zhuǎn)染時間，并分別檢測其轉(zhuǎn)染效率，希望對今后納米材料在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、運輸干擾RNA及藥物治療載體等生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

293T及C2C12細(xì)胞由新疆畜牧科學(xué)院綿羊中心實驗室保存;培養(yǎng)細(xì)胞器皿及耗材購自上海生工生物公司;GFP質(zhì)粒由新疆畜牧科學(xué)院綿羊中心實驗室制備。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS從Hyclone公司購買;DEME培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司;甘氨酸購自Bio-Rad公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000從Invtitrogen公司購買;化學(xué)試劑購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 LDH的制備 配制A溶液(含0.3 mmol/L MgCl2和 0.1 mmol/L AlCl3):稱 取0.609 9 g MgCl2·6H2O 和 0.241 4 g AlCl3·6H2O，溶于 10 ml去離子水中;配制B溶液(0.15 mmol/L NaOH):稱取0.240 g NaOH，溶于40 m l去離子水中。將10 ml A溶液邊攪拌邊加入40 m l B溶液中。將混合液隔絕空氣磁力攪拌10 min。4 500 r/min離心10 min，將沉淀洗滌2次。將沉淀溶于40 ml去離子水中，37 ℃ 300 r/min攪拌10 min，并定容到45 ml，放入特制的不銹鋼皿中。100℃加熱16 h。將混合液自然冷卻到室溫，放置備用。

1.2.2 LDH表型的測定 將10μl LDH加入到90 μl無水乙醇中，振蕩混勻10 min，然后進(jìn)行透射電鏡掃描。

1.2.3 LDH轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將凍存在液氮中的293T細(xì)胞取出，迅速加入到40℃的水中，快速攪動，待細(xì)胞完全融化，將其轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，并加入5 m l D-Hanks溶液，3 000 r/min離心10 min，棄上清，將底層細(xì)胞分散在7 ml 10%FBS培養(yǎng)基中。在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。C2C12細(xì)胞同法處理。待細(xì)胞生長融合度達(dá)到95%以上時進(jìn)行傳代，小心倒掉原有培養(yǎng)基，用4 ml D-Hanks溶液輕輕晃動清洗細(xì)胞后將液體倒掉，重復(fù)此步驟;再加入500μl胰酶，上下、左右輕輕晃動，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)放置2 min;取出后從培養(yǎng)瓶底部輕拍至所有細(xì)胞完全脫離瓶壁，加入5 ml DMEM吹散細(xì)胞，使其充分懸浮后棄去2ml懸浮液，將剩余細(xì)胞懸浮加入到7ml10%FBS培養(yǎng)基中，上下、左右、前后晃動至分散均勻，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，傳至3～4代。C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)方法同293T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，將復(fù)蘇的C2C12細(xì)胞中加入10%FBS+100 U/mg青霉素+100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)至G3代。提取含有eGFP基因的質(zhì)粒，取 LDH(0.80%)100 μl和質(zhì)粒(1.6 μg/μl)20 μl混合30 min。將混合物離心10 min，將沉淀重懸于1 ml 10%血清培養(yǎng)基中，靜置10 min。與此同時，將6孔板中的細(xì)胞用1%Dhanks沖洗細(xì)胞2遍后，加入2 ml 10%血清培養(yǎng)基。將LDH混合液加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2中保溫3 h。之后，更換含有10%血清的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2中保溫12～72 h檢測轉(zhuǎn)染水平。根據(jù)不同DNA/LDH的質(zhì)量比(0/50～10/50)，根據(jù)不同的培養(yǎng)時間(12 h、24 h、36 h、48 h、56 h)，設(shè)計梯度試驗。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 在平板中加入胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，用1×PBS洗1遍，4 500 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟3遍。之后將細(xì)胞重懸于10 ml雙蒸水中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒的結(jié)構(gòu)

Mg2Al-Cl-LDH是層狀雙氫氧化物，由二價的鎂離子和三價的鋁離子組成，化學(xué)組成式為Mg2Al(OH)6(Cl)·1.5H2O，它是具有水滑石層狀晶體結(jié)構(gòu)的混合金屬氧化物，其基本結(jié)構(gòu)單元是鎂鋁氫氧化物六邊形結(jié)構(gòu)層，其片面重疊形成水滑石晶體顆粒。在150 000×透射電鏡下觀察，Mg2Al-Cl-LDH顆粒大小有差異，顆粒直徑主要分布在100 nm左右(圖1)。

圖1 M g2 A l-Cl-LDH顆粒在透射電鏡下的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Mg2 Al-Cl-LDH particles in a transmission electron microscope

2.2 Mg2 Al-Cl-LDH的細(xì)胞毒性

以不同濃度(0～500μg/ml)的LDH懸液加入到每孔含有4×105個細(xì)胞的平板中，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞活性。納米顆粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，隨著顆粒濃度的增加，細(xì)胞活性呈先下降后上升再下降的趨勢(圖2)。當(dāng)LDH濃度過高時，細(xì)胞無法胞吞過多的納米顆粒，過多的顆粒分散在細(xì)胞培養(yǎng)基中，使細(xì)胞的呼吸和生長都受到影響，最終使細(xì)胞活性下降甚至死亡。LDH濃度為200 μg/ml時，細(xì)胞活性比較強，但是與其他濃度之間的差異不大，當(dāng)LDH濃度為500μg/ml時細(xì)胞活性下降非?？?。

比較脂質(zhì)體和納米轉(zhuǎn)染結(jié)果可見，納米材料與脂質(zhì)體同轉(zhuǎn)染10μg/ml熒光質(zhì)粒時，納米材料的轉(zhuǎn)染效果不如脂質(zhì)體理想。

圖2 不同LDH濃度下的細(xì)胞毒性測定Fig.2 Cytotoxicity in different concentrations of LDH

2.3 Mg2 Al-Cl-LDH納米材料轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系的建立

LDH作為投遞基因的載體，攜帶eGFP基因進(jìn)入細(xì)胞，其表達(dá)的蛋白質(zhì)具有熒光，因此可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，從而判斷轉(zhuǎn)染效率的水平。以不同DNA/LDH質(zhì)量比(0/50～10/50)進(jìn)行試驗，流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示4/50的比例下轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到了11.17%(圖3)。

圖3 不同DNA/LDH質(zhì)量比下的轉(zhuǎn)染效率Fig.3 The efficiency of transfection of the system with differentmass ratios of DNA/LDH

在LDH和質(zhì)粒DNA混合反應(yīng)的過程中，時間對反應(yīng)是有影響的，隨著時間從5 min到30 min，兩者相互吸附的數(shù)量呈先上升后下降的趨勢(圖4)。在15 min時相互吸附的數(shù)量最多，轉(zhuǎn)染后表達(dá)的熒光蛋白質(zhì)也最多，轉(zhuǎn)染率達(dá)到最高值(6.07%)。

圖4 不同的DNA和LDH反應(yīng)時間下的轉(zhuǎn)染效率Fig.4 Transfection efficiency of the system with different reaction time of DNA and LDH

當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，隨著培養(yǎng)時間的增加，從12 h時的轉(zhuǎn)染率3.5%上升達(dá)到48 h時的最大值12.6%，隨后出現(xiàn)下降的趨勢(圖5)。在72 h時由于細(xì)胞培養(yǎng)時間過久，密度過大，細(xì)胞無法正常呼吸和生長，活性降低，活細(xì)胞數(shù)量降低，表達(dá)出的GFP蛋白質(zhì)也減少。當(dāng)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞時也呈現(xiàn)隨著時間的延長先上升后下降的趨勢，但是C2C12細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染率比293T細(xì)胞高，平均轉(zhuǎn)染率達(dá)到13.6%，最大值為17.4%。

因此確定Mg2Al-Cl-LDH納米材料轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系:DNA/LDH的質(zhì)量比為4/50，DNA與LDH的混合時間為15 min，細(xì)胞培養(yǎng)時間為48 h，納米顆粒濃度為200 mg/L。

圖5 HEK 293T和C2 C12細(xì)胞在不同培養(yǎng)時間下的轉(zhuǎn)染效率Fig.5 Transfection efficiencies of HEK 293T cells and C2 C12 cells cultured for different time

3 討論

3.1 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

有研究結(jié)果表明Mg2Al-Cl-LDH中由于高價的Al3+取代了部分低價的 Mg2+，使得正電荷過剩，Mg2Al-Cl-LDH帶正電，這些過剩的正電荷由反離子平衡，反離子和部分水分子存在于兩個類水鎂石片中間的間隙里而層板上有氫氧基團(tuán)，它的堿性位可使其與其他化合物反應(yīng)，從而提供了豐富的堿中心，使其更穩(wěn)定。另外LDH間層的陰離子可在一定條件下與各種功能陰離子進(jìn)行交換，使LDH成為具有應(yīng)用性能的超分子插層結(jié)構(gòu)材料［6］。通過插層使體積較大的陰離子取代體積較小的陰離子進(jìn)入層間，得到更多的反應(yīng)空間和暴露更多的活性中心，使它的催化性能更為顯著［7］。并且其粒子大小及粒子分布可以通過合成方法和條件進(jìn)行控制，本試驗中Mg2Al-Cl-LDH顆粒直徑主要分布在100 nm左右。

然而納米顆粒制作后，在透射電鏡下還是可以看到一些沒有結(jié)合的分子晶體，說明結(jié)合效率不能達(dá)到100%。并且Mg2Al-Cl-LDH顆粒是不穩(wěn)定的，放置一周之內(nèi)，顆粒狀態(tài)比較穩(wěn)定，顆粒分散均勻，懸液顏色清澈，但是時間超過一周，隨時間的延長，顆粒出現(xiàn)團(tuán)集，形成大分子的顆粒，懸液也變得渾濁，從而影響轉(zhuǎn)染效率。

3.2 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒與質(zhì)粒DNA的作用

Mg2Al-Cl-LDH顆粒有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，因此能夠通過靜電吸附作用攜帶帶負(fù)電荷的基因物質(zhì)如寡核苷酸，通過空間位阻效應(yīng)，防止體內(nèi)DNA酶對寡核苷酸的降解，并且能夠?qū)?fù)合的 DNA運送到細(xì)胞核內(nèi)，實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染［8］。在復(fù)合的過程中，由于納米顆粒整體呈現(xiàn)堿性，帶負(fù)電荷的Cl-離子位于雙層結(jié)構(gòu)的中間，帶正電荷的離子會延展到雙層結(jié)構(gòu)的外部，與帶負(fù)電的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)相互復(fù)合。因此當(dāng)納米顆粒與核酸物質(zhì)相結(jié)合的時候，核酸物質(zhì)的負(fù)電荷與納米顆粒的正電荷隨著濃度的變化，兩者的結(jié)合能力也發(fā)生著變化，本試驗中DNA/LDH質(zhì)量比為4/50時轉(zhuǎn)染效率最高，可能就是因為此時的正負(fù)電荷比例最恰當(dāng)。同時兩者電荷比例的變化還會降低由過強正電荷產(chǎn)生的載體本身的細(xì)胞毒性，也可增加轉(zhuǎn)染效率，本試驗中200 μg/m l納米顆粒濃度下細(xì)胞活性還可達(dá)到83%。隨著時間的變化，兩者的復(fù)合數(shù)量先增加然后減少，說明兩者的復(fù)合作用是不穩(wěn)定的，在15 min時，穩(wěn)定性比較高。Mg2Al-Cl-LDH是可生物降解的高分子材料，當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時細(xì)胞活性還是比較強的，然而達(dá)到500μg/ml時細(xì)胞活性下降非?？?，說明即使納米顆?？山到?，但是還是有細(xì)胞毒性的。

3.3 Mg2 Al-Cl-LDH顆粒與細(xì)胞膜的相互作用

因為Mg2Al-Cl-LDH顆粒與DNA分子相互結(jié)合后形成的團(tuán)聚體正好能夠被細(xì)胞胞吞，并且能夠在細(xì)胞漿內(nèi)釋放DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，有人認(rèn)為，納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞主要取決于顆粒的粒徑大?。?］。當(dāng)顆粒粒徑在小于200 nm時，細(xì)胞容易以網(wǎng)格蛋白質(zhì)介導(dǎo)的主動胞吞方式將顆粒胞吞入細(xì)胞;而500 nm左右的顆粒以細(xì)胞質(zhì)膜微囊的胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞。Mg2Al-Cl-LDH顆粒大小為100 nm左右，因此推測本試驗納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的過程應(yīng)該與網(wǎng)格蛋白質(zhì)的介導(dǎo)有關(guān)［10］。然而不同細(xì)胞的網(wǎng)格蛋白質(zhì)數(shù)量和介導(dǎo)能力可能不同，所以出現(xiàn)了293T和C2C12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不同，也有可能是細(xì)胞培養(yǎng)時用的都是六孔板，C2C12的細(xì)胞形態(tài)大，相對生長密度就小，相對轉(zhuǎn)染效率就高。與脂質(zhì)體相比，無論是使用293T細(xì)胞還是C2C12細(xì)胞，納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率都還是比較低的，然而納米載體具有安全性高、易于制備和工藝放大、不會引起特異的免疫應(yīng)答等優(yōu)勢。

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