王 健， 董 飚， 龔道清

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.國家級水禽基因庫，江蘇 泰州 225300;3.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

在動物生產(chǎn)中，動物攝入能量首先用于維持，然后多余的才會被用于生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化為脂肪等形式儲存起來。脂肪組織可以儲存能量，還可參與能量代謝和平衡［1］。禽類的脂肪沉積主要集中在皮下脂肪和腹脂，但這些脂肪并不符合現(xiàn)代消費(fèi)者的需求。影響禽類的脂肪沉積的因素較多，其中遺傳和營養(yǎng)是最主要的因素。如何降低禽類的脂肪沉積能力，提高經(jīng)濟(jì)效益，降低飼料成本，國內(nèi)外禽類遺傳育種學(xué)者參與了動物脂肪沉積的研究，其中功能基因是研究方向之一。脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的一種膠原樣細(xì)胞因子，人和哺乳動物脂聯(lián)素基因包含了3個外顯子和2個內(nèi)含子［2-3］，禽類脂聯(lián)素只有2個外顯子和1個內(nèi)含子［4］。脂聯(lián)素基因最初是在人類上進(jìn)行了研究，主要認(rèn)為其與II型糖尿病有顯著性關(guān)系，然后才逐漸轉(zhuǎn)移到哺乳動物、禽類上進(jìn)行研究。在鴨、鵝方面的研究主要集中在多態(tài)位點(diǎn)的檢測、基因克隆、mRNA在不同組織或者時期的表達(dá)規(guī)律等［5-11］。本文擬尋找出中國部分地方白鵝品種脂聯(lián)素基因在外顯子上可能存在的點(diǎn)突變，檢測其在不同鵝品種中分布情況，分析群體遺傳參數(shù)，為鵝品種鑒定、保存和選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用太湖鵝、豁眼鵝、四川白鵝、浙東白鵝、皖西白鵝5種白鵝均由國家級水禽基因庫所提供，每個品種60只，公母各半。翅靜脈采取血樣，4%EDTA進(jìn)行抗凝，采用酚/氯仿法提取基因組DNA，并溶解于水中備用。

1.2 PCR引物的設(shè)計

根據(jù)鵝脂聯(lián)素基因DNA序列(GenBank No:EU370686)設(shè)計2對引物，擴(kuò)增第2外顯子序列。ADP1上游引物序列:5'-ACTCCTGATCCCAACTCTGT-3'、下游引物序列:5'-GTCGTAGTGGTTCTGCTCGT-3'，退火溫度為56℃，擴(kuò)增長度為245 bp;ADP2上游引物序列:5'-ACGAGCAGAACCACTACGAC-3'、下游引物序列:5'-TGAGATGGAGCAAGACCGAG-3'，退火溫度為55℃，擴(kuò)增長度為204 bp。

1.3 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增體系為20.00 μl，包括10 ×PCR buffer(無 Mg2+)2.00 μl、10 mmol/L dNTPs 2.00 μl、25 mmol/L MgCl21.20 μl、10 pmol/L 上下游引物各0.80 μl、5 U/μl Taq 酶 0.12 μl、100 ng/μl DNA 模板 0.80 μl、加 ddH2O 至 25.00 μl。PCR 擴(kuò)增條件為94℃變性5 min;94℃ 30 s，56/55℃ 30 s，72℃30 s共35個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 SSCP分型與測序

在5 μl PCR產(chǎn)物中加入5 μl上樣緩沖液進(jìn)行混合，98℃變性10 min，迅速插入冰中，放置5 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染顯色、判型。挑選純合基因型個體的PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到PMD18-T載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α上，經(jīng)過鑒定后送上海桑尼生物工程有限公司進(jìn)行序列測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運(yùn)用DNAMAN軟件比對尋找出不同基因型間存在的點(diǎn)突變。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠染色圖統(tǒng)計出各個群體基因型數(shù)，進(jìn)而計算出基因型頻率和等位基因頻率，用卡方檢驗分析不同基因型在群體之間差異情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR 檢測結(jié)果

將2對引物分別對部分鵝基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1.5%瓊脂糖電泳上檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性好，可以直接進(jìn)行SSCP分析。

2.2 SSCP 檢測結(jié)果

引物ADP1對不同鵝品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行SSCP檢測，結(jié)果顯示引物ADP1擴(kuò)增的片段上存在多態(tài)，主要存在3種基因型，分別命名為XX、XY和YY(圖1)。引物ADP2對不同鵝品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行SSCP檢測，結(jié)果顯示引物ADP2擴(kuò)增的片段上沒有多態(tài)性。

圖1 引物ADP1對部分鵝品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP分析Fig.1 SSCP analysis of goose breeds PCR products with primer ADP1

2.3 多態(tài)性基因片段的克隆與測序

取XX和YY基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行片段回收、克隆和測序。運(yùn)用生物學(xué)軟件DNAMAN分析測序結(jié)果，其中YY型與GenBank中上傳的鵝脂聯(lián)素基因序列一致;XX型與YY型相比，在外顯子第351處發(fā)生了腺嘌呤(A)→尿嘧啶(G)突變(圖2)，該突變未引起氨基酸發(fā)生變化。

圖2 不同基因型間核苷酸序列比較Fig.2 Comparison of nucleotide sequence among different genotypes of goose

2.4 不同鵝品種基因型(基因)頻率比較

對不同鵝品種分別進(jìn)行基因型檢測，計算不同鵝品種的基因型頻率和基因頻率(表1)。太湖鵝以XY基因型較高，YY基因型次之;皖西白鵝、浙東白鵝和四川白鵝均以YY型基因型為主，XY基因型次之，XX基因型比例極小，其中皖西白鵝和浙東白鵝YY型幾乎是XY型的2倍;豁眼鵝以XX和XY基因型為主，YY基因型比例相對較低?；硌垸Z以X等位基因為優(yōu)勢基因，其他5個鵝品種均以Y等位基因為優(yōu)勢基因，其中浙東白鵝Y等位基因頻率最高，達(dá)0.833 3。

由表2可知，豁眼鵝基因型分布與其他鵝群體存在極顯著差異;浙東白鵝基因型分布與太湖鵝、四川白鵝存在顯著差異;其他鵝品種之間無顯著性差異。

表1 不同鵝品種基因型及等位基因頻率Table 1 The frequencies of genotypes and alleles among different breeds of goose

表2 不同基因型在鵝品種之間的卡方檢驗結(jié)果Table 2 The χ2detection of genotypes in different breeds of goose

2.5 遺傳特性分析

群體遺傳分析結(jié)果(表3)顯示，浙東白鵝純合度最高，為0.722 2;皖西白鵝次之，為0.670 1;豁眼鵝最低，為0.508 9。除浙東白鵝為低度多態(tài)外，其他4個鵝品種為中度多態(tài)，其中以豁眼鵝多態(tài)信息含量最高，為0.370 5。

表3 不同鵝品種的遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters for different breeds of goose

3 討論

脂聯(lián)素基因在禽類群體中均存在，在同一物種或品種，脂聯(lián)素基因在序列上絕大部分是相同的，只有少數(shù)堿基存在差異，這就是所謂的點(diǎn)突變。這些點(diǎn)突變在內(nèi)含子中的變化影響作用要小于在外顯子上，外顯子上的點(diǎn)突變可以引起某個氨基酸或者整個氨基酸序列變化，從而影響該序列編碼蛋白質(zhì)的功能。在外顯子上點(diǎn)突變主要分為同義突變、錯義突變和無義突變。本研究在外顯子2上設(shè)計了2對引物，首次在鵝脂聯(lián)素基因外顯子上發(fā)現(xiàn)了點(diǎn)突變，突變位置為第351處，是腺嘌呤(A)與尿嘧啶(G)之間發(fā)生了突變，該突變未引起氨基酸發(fā)生變化。與鴨相比，其在外顯子2上的點(diǎn)突變數(shù)較少［7］，這說明鵝在進(jìn)化過程中比較保守。

在太湖鵝、皖西白鵝、豁眼鵝、四川白鵝和浙東白鵝5個中國地方白鵝群中存在3種基因型，分別為XX型、YY型和XY型。太湖鵝、皖西白鵝、四川白鵝和浙東白鵝主要以XY型、YY型2種形式存在，另外，4種鵝Y等位基因頻率均明顯高于X等位基因頻率?；硌垸Z主要以XX型、XY型2種基因型存在，2個等位基因頻率之間的差異相對于其他4個品種來說要小很多。不同等位基因在品種之間分布情況顯示，豁眼鵝與其他4個鵝之間存在顯著性差異，浙東白鵝與太湖鵝、四川白鵝之間存在顯著性差異?；硌垸Z為小型品種，其產(chǎn)蛋率在中國地方品種中最高，主要分布在山東省、遼寧省內(nèi);太湖鵝也屬于小型品種，主要分布于江蘇省和浙江省的太湖流域;浙東白鵝為中型品種，主要分布于浙江省東部。皖西白鵝屬于中型品種，主要分布于安徽省西部;四川白鵝屬于中型品種，主要分布于四川省。在品種進(jìn)化過程中，因自然和人類的影響使得不同品種向不同生產(chǎn)性能方向進(jìn)化，間接導(dǎo)致不同品種之間脂聯(lián)素基因型頻率產(chǎn)生了差異。品種之間的基因型頻率差異為品種選育和進(jìn)行品種雜交提供了素材。在禽類上已經(jīng)有了一些關(guān)于脂聯(lián)素基因點(diǎn)突變與生產(chǎn)性能之間的關(guān)聯(lián)性分析的報道，劉大林等分析了京海黃雞脂聯(lián)素基因第1內(nèi)含子中的1個點(diǎn)突變與屠體性狀的遺傳效應(yīng)，提出脂聯(lián)素基因可能是調(diào)控脂肪性狀的主效基因或與主效基因連鎖［12］。張依裕等在白羽番鴨內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了C→T突變，發(fā)現(xiàn)CC純合子的白羽番鴨肉質(zhì)更好［13］。

本研究以脂聯(lián)素基因中存在的多態(tài)位點(diǎn)分析了5個白鵝群體的遺傳參數(shù)，以浙東白鵝、皖西白鵝的純合度較高，豁眼鵝純合度最低。結(jié)合群體遺傳信息含量，表明豁眼鵝擁有最豐富的遺傳信息，其選擇的遺傳潛力最大，這與品種形成時間最短也有一定的關(guān)系，說明其選擇的時間較短;另外，浙東白鵝的遺傳信息含量最低。這些結(jié)果與董飚等在研究脂聯(lián)素基因內(nèi)含子遺傳多樣性中的分析結(jié)果一致［7］。

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