邢玉娟， 陳玉庫， 胡元亮， 王德云， 陳 茜， 郭振環(huán)， 王君敏， 趙曉娜

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室，江蘇 南京 210095)

研究證明，中藥作為一種免疫增強劑，具有來源廣泛、效果顯著、無毒副作用等優(yōu)勢，不僅能克服油乳類、鋁膠類化學(xué)佐劑副作用大、局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊?。?-2］，而且能顯著增強機體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌［3-4］。

在以前的研究中，筆者首先通過體外試驗篩選出氧化苦參堿(OM)、黃芪多糖(APS)等具有顯著抑制新城疫病毒(NDV)增殖作用的中藥成分，然后比較了中藥成分復(fù)方體外抗NDV感染的效果，結(jié)果表明中藥成分復(fù)方無論是高濃度，還是中、低濃度都能顯著抑制NDV感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)［5］。通過臨床試驗比較了中藥成分復(fù)方對雛雞人工感染新城疫的療效，結(jié)果表明，在攻毒前、與攻毒同時和攻毒后給藥，中藥成分復(fù)方均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價，減輕死亡雞的器官出血［6］。

本試驗在測定了OM、APS、甘草酸(GA)、桅子苷(GP)等4種中藥成分體外對雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，篩選出具有較好增強免疫效果的OM和APS基礎(chǔ)上，擬使用OM和APS的中藥成分復(fù)方OM-APS(OAP)及其組分藥配合新城疫疫苗免疫，測定雛雞免疫后外周血T淋巴細(xì)胞增殖、血清抗體效價和細(xì)胞因子的變化，旨在闡明中藥成分復(fù)方免疫增強的作用機理，為研制中藥成分免疫增強劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

根據(jù)以前的試驗結(jié)果［5-6］，分別用雙蒸水將OM、APS 和 OM-APS(OAP)稀釋成 4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml，分別代表高、中、低 3 種濃度，常規(guī)消毒后備用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系(Newcastle Disease virusⅣ strain，NDV-Ⅳ)疫苗，中牧股份南京藥械廠生產(chǎn)，批號753-3。新城疫檢測抗原，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)研究室提供。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4℃保存，臨用前加入犢牛血清達5%和青霉素、鏈霉素各100 IU/ml;植物血凝素(PHA)，上海伊華科技有限公司產(chǎn)品，用 RPMI1640培養(yǎng)液配制成 0.1 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后－20℃保存;四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液，Amresco公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，使終濃度為5 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃冰箱避光保存;淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞裂解液，二甲基亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.4 試驗動物

1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞700羽，購自南京湯泉農(nóng)墾種雞場。試驗期間采用籠養(yǎng)，全價飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.5 試驗設(shè)計

雛雞飼養(yǎng)至14日齡去除病弱雞，選取660羽［平均體重95 g，平均母源抗體效價(2.4±0.5)lg2］，隨機均分為11組。第1～9組為OAP高劑量組(OAPH)、OAP中劑量組(OAPM)、OAP低劑量組(OAPL)、OM高劑量組(OMH)、OM中劑量組(OMM)、OM 低劑量組(OML)、APS高劑量組(APSH)、APS中劑量組(APSM)和 APS低劑量組(APSL)，第10組為疫苗對照組，第11組為空白對照組。除空白對照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點眼免疫，每羽1份。28日齡二免。在首次免疫的同時，3個中藥復(fù)方組分別口服高、中、低劑量的OAP、OM和APS，免疫對照組和空白對照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。在首次免疫同時，分別于14、21、28、35、42 日齡采血，抗凝血 MTT 法測定外周血淋巴細(xì)胞增殖，非抗凝血血清用β-微量法測定HI抗體效價。于14、28、42日齡，采血分離血清，用ELISA方法檢測IL-2和IFN-γ的含量。

1.6 淋巴細(xì)胞增殖測定方法

采用MTT法［3-4］測定淋巴細(xì)胞增殖情況。將抗凝血樣(每羽2 ml)用Hank’s液稀釋1倍，小心加在淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用無血清RPMI1640營養(yǎng)液洗2遍，每分鐘1 500 r/min離心15 min。臺盼藍染色，細(xì)胞計數(shù)，活細(xì)胞大于90%后，用RPMI1640營養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ml 2.5×106個，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(德國Nunclon公司生產(chǎn))中，每孔80 μl，再加20 μl PHA，每個樣品重復(fù) 4 孔，然后置于39.5℃、5%CO2條件下(CO2培養(yǎng)箱，美國 Revco 公司產(chǎn)品)培養(yǎng)44 h，每孔加入 MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加裂解液100 μl，將細(xì)胞板置于微量振蕩器(75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn))上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀(DG-3022型，中國華東電子管廠生產(chǎn))上檢測570 nm處的吸光值(A570)作為T淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.7 抗體效價測定方法

在96孔微量血凝板上，從左到右每孔各加50 μl PBS液，再向每排的第1孔加入50 μl待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50 μl 4個單位的抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min。取出向每孔加入50 μl雞紅細(xì)胞懸液，同時設(shè)陽性血清、陰性血清及空白對照孔。振蕩混勻后置于37℃溫箱中感作30 min，待對照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時觀察結(jié)果［7］。

1.8 IL-2 和 IFN-γ 的測定

分離血清后按照試劑盒說明書測定IL-2和IFN-γ的含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS軟件12.0統(tǒng)計分析，比較各組間的差異性。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞增殖的變化

從表1可以看出，免疫組各時間點A570值均顯著高于空白對照組(P＜0.05)。OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在雛雞各日齡段，OAPL和APSL在 21、28、35 和 42 日齡，OML在 21、28 和 42日齡的A570值顯著高于免疫對照組;OAPH在雛雞各日齡段，A570值均顯著高于 OMH和 APSH(P＜0.05);OAPM在28日齡 A570值高于 APSM，但差異不顯著，其余日齡段 A570值均顯著高于 OMM和APSM(P ＜0.05);復(fù)方組(OAPH、OAPM、OAPL)和OMH、APSH在21日齡A570值達到高峰，其余各單味藥對照組在28日齡達到高峰。

表1 淋巴細(xì)胞的增殖Table 1 Proliferations of T lymphocytes

2.2 抗體效價的變化

從表2可以看出，所有處理抗體效價均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞14日齡，OMH、OMM在 21 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和 APSM在 28 日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在 35 日齡，OAPH、OAPM、APSM在 42 日齡抗體效價顯著高于免疫對照組;OAPH的抗體效價在各時間點均顯著高于OMH和APSH(P＜0.05);OAPM抗體效價在21、28、35、42 日齡顯著高于OMM，21、28和35日齡顯著高于APSM(P＜0.05);OAPL抗體效價在28日齡顯著高于OML(P＜0.05)。

表2 血清抗體效價的變化(lg2)Table 2 Changes of the serum antibody titers(lg2)

2.3 血清中IL-2水平的變化

從表3可以看出，所有免疫組血清IL-2濃度均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM、OAPL、OMH、OMM、APSH、APSM在各日齡段、OML在42日齡、APSL在14和42日齡血清IL-2濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05);OAPH在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在各日齡段血清IL-2濃度均顯著高于OMM和APSM，OAPL在28、42日齡血清 IL-2濃度顯著高于 OML和 APSL(P＜0.05)。APSL和空白對照組血清中IL-2濃度在14日齡達到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達到峰值。

表3 血清中IL-2濃度的變化Table 3 Changes of IL-2 concentrations in serum

2.4 血清中IFN-γ 水平的變化

從表4可以看出，口服中藥的9個處理在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于空白對照組(P＜0.05);OAPH、OAPM在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。APSH、APSM在28和42日齡，OAPL在42日齡，OMM在42日齡血清IFN-γ濃度均顯著高于免疫對照組(P＜0.05)。OAPH在雛雞各日齡段血清IFN-γ濃度均顯著高于OMH和APSH，OAPM在28、42日齡血清IFN-γ濃度顯著高于 OMM和 APSM(P＜0.05)。OAPL、OMH、OMM、OML、APSL和免疫對照組血清中 IFN-γ濃度在14日齡達到高峰，然后下降，其余各組均在28日齡達到峰值。

表4 血清中IFN-γ濃度的變化Table 4 Changes of IFN-γ concentrations in serum

3 討論

3.1 中藥成分復(fù)方及其組分藥對細(xì)胞免疫和體液免疫的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機體細(xì)胞免疫水平的一個重要指標(biāo)［7］。細(xì)胞免疫可以通過致敏淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。唐雪明和孔祥峰等也通過體內(nèi)外試驗證實黃芪多糖及其復(fù)方具有提高雞淋巴細(xì)胞增殖的作用，并且具有一定的劑量效應(yīng)［8-9］。本試驗結(jié)果表明，與免疫對照組比較，OAP、OM、APS均具有增強淋巴細(xì)胞增殖的作用，高劑量的效果優(yōu)于低劑量。

血清抗體效價反映機體體液免疫狀態(tài)，體液免疫是機體抗御感染的主要因素之一，通過抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用［10］。王德云等亦研究報道黃芪多糖及其復(fù)方等具有提高機體特異性抗體的效果，高劑量促進抗體生成的作用強于低劑量［7］。本試驗結(jié)果表明，與免疫對照組比較，OAP、OM、APS均具有提高新城疫特異性抗體的作用，增強機體體液免疫的效果，且高劑量效果優(yōu)于低劑量。

3.2 中藥成分復(fù)方及其組分藥對細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子是一類主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的極微量的具有廣譜生物學(xué)活性的小分子肽，是免疫系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)因子，病原感染或疫苗接種產(chǎn)生的細(xì)胞因子決定免疫反應(yīng)的類型和程度。IL-2是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可以輔助CTL細(xì)胞表達殺傷功能，IFN-γ是由T淋巴細(xì)胞不同的亞群分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤和雙向免疫調(diào)節(jié)作用，同時對不同免疫細(xì)胞間相互作用和發(fā)揮免疫功能具有重要的介導(dǎo)作用［11］。

本試驗結(jié)果表明，OAP、OM、APS均具有促進細(xì)胞因子分泌，提高血清中IL-2和IFN-γ濃度的作用。并且在選用的劑量中，高劑量和中劑量組在雛雞多個日齡段提高血清中2種細(xì)胞因子濃度的作用強于低劑量。馬霞、王德云、陳玉庫等也通過試驗證明，黃芪多糖、氧化苦參堿和黃酮等中藥成分及其復(fù)方體內(nèi)外均具有促進IL-2、IL-6和IFN-γ等細(xì)胞因子分泌，攻毒保護試驗也表明細(xì)胞因子高劑量用藥組保護率也相應(yīng)高于低劑量用藥組［12-14］。

3.3 復(fù)方增強免疫作用與單味組分藥的比較

本試驗結(jié)果表明，OAP是由OM和APS組成的復(fù)方，在促進淋巴細(xì)胞增殖、提高特異性抗體生成、增加細(xì)胞因子分泌等增強免疫作用方面，同等劑量復(fù)方多優(yōu)于單味組分藥，表明兩種組分藥有協(xié)同作用。王德云等研究當(dāng)歸多糖、黃芪多糖及其復(fù)方等對培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖、抗體生成、細(xì)胞因子分泌的影響，也得到相似結(jié)果［7，13］。范云鵬等研究中藥成分黃酮及其復(fù)方增強免疫作用時，也發(fā)現(xiàn)復(fù)方的作用效果優(yōu)于單味成分［15］。研究只報道了中藥或中藥成分復(fù)方的生物活性高于其單味藥的現(xiàn)象，這可能與中獸醫(yī)的配伍理論有關(guān)，具體機制仍需進一步研究。

綜合以上結(jié)果，OAP增強雛雞對新城疫疫苗的免疫效果最好，可作為新型免疫增強劑的候選藥方。鑒于中、高劑量的效果多差異不顯著，推薦臨床使用OAP中劑量配合疫苗使用。

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