劉笑宏，張麗麗，王春燕，慈志娟，于海軍，李公存，顧亮，趙玲玲

(1.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究所，山東 濟(jì)南 250000；3.海陽(yáng)市果業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 海陽(yáng) 265100)

藍(lán)莓是我國(guó)主要生態(tài)經(jīng)濟(jì)林漿果，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，風(fēng)味獨(dú)特，被評(píng)為“人類(lèi)五大健康食品之一”[1]，列入世界第3代水果行列[2]。花色苷是藍(lán)莓重要的品質(zhì)性狀，其生物合成受內(nèi)部因素(合成途徑關(guān)鍵酶活性及相關(guān)基因表達(dá)量等)和外界環(huán)境因子(溫度、空氣濕度、光照等)的共同影響[3－5]。研究表明，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)是花色苷合成過(guò)程的起始酶，起限速作用；查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)可催化生成柚皮素查爾酮；查耳酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)可顯著提高花色苷合成速率；黃烷酮3－羥化酶(flavanone 3－h(huán)ydroxylase，F(xiàn)3H)是花色苷合成途徑的中樞酶；二氫黃酮醇4－還原酶(dihydroflavonol 4－reductase，DFR)對(duì)花色苷積累起限制因素；花色素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)是花色苷合成和原花青素合成樞紐的關(guān)鍵酶，決定花色苷合成途徑的走向；類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP－glucoseflavonoid 3－O－glucosyltransferase，UFGT)是花色苷合成的最終作用酶；糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GLH)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)對(duì)花色苷的分解氧化起重要作用[6－10]?；蚴菦Q定酶活性的關(guān)鍵因素，環(huán)境因素則通過(guò)影響酶活性影響花色苷的最終合成。環(huán)境因素中，光照是花色苷合成的重要前提[11，12]，適量光照可有效提高花色苷的合成量，而強(qiáng)光則會(huì)降低花色苷的含量[13]；溫度是影響花色苷代謝的第二因素[14，15]，高溫能降解花色苷[16，17]，低溫則抑制花色苷的合成[18]；空氣濕度對(duì)花色苷的積累同樣重要，較高的空氣相對(duì)濕度可降低蒸騰速率、提高光合產(chǎn)物積累，從而為花色苷代謝提供充足的合成底物[19，20]。

膠東半島氣候溫暖濕潤(rùn)，是我國(guó)重要的藍(lán)莓生產(chǎn)區(qū)[21]，傳統(tǒng)以栽植北高叢藍(lán)莓為主。近年來(lái)，南高叢藍(lán)莓由于品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)性高等特點(diǎn)，被大規(guī)模引種，但因花期較早，易受霜凍危害，在膠東地區(qū)較為適合設(shè)施栽培。奧尼爾和米斯蒂均為引入的優(yōu)良南高叢藍(lán)莓品種，奧尼爾果個(gè)大、香氣濃郁，米斯蒂有特殊香氣，均深受消費(fèi)者喜愛(ài)，表現(xiàn)出較高的商品價(jià)值。但引種后生長(zhǎng)環(huán)境的改變?nèi)菀讓?dǎo)致藍(lán)莓果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分及含量變化，從而對(duì)其品質(zhì)造成一定影響?；ㄉ兆鳛樗{(lán)莓的主要活性物質(zhì)，其含量改變明顯影響藍(lán)莓果實(shí)品質(zhì)，因此，了解生長(zhǎng)環(huán)境條件對(duì)花色苷積累和代謝的影響對(duì)于改善藍(lán)莓品質(zhì)具有重要意義。

本試驗(yàn)以膠東地區(qū)設(shè)施栽培的奧尼爾和米斯蒂兩個(gè)品種藍(lán)莓為研究對(duì)象，分析轉(zhuǎn)色期各階段花色苷積累及代謝途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的情況，并探究設(shè)施環(huán)境因子對(duì)花色苷積累的影響，以期為藍(lán)莓花色苷代謝研究及生產(chǎn)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2021年在山東省煙臺(tái)市福山區(qū)藍(lán)莓生產(chǎn)基地進(jìn)行。福山區(qū)位于膠東半島北部，屬暖溫帶東亞季風(fēng)區(qū)大陸性氣候，夏季溫暖濕潤(rùn)，冬季寒冷干燥，年平均降水729.2 mm，平均氣溫11.8℃，平均日照2672.2 h，空氣相對(duì)濕度65%，適合藍(lán)莓生長(zhǎng)發(fā)育。

1.2 試驗(yàn)材料

供試藍(lán)莓品種為奧尼爾和米斯蒂，均于2017年定植于東西向暖棚內(nèi)，供試品種南北向種植，株距0.8 m，行距1.8 m，栽培管理措施一致。每個(gè)小區(qū)由4個(gè)種植行組成，按種植行從東到西、植株從南到北的次序，每一種植行順次選擇5株藍(lán)莓(即第一行的5株在種植行的南邊、第二行5株接著第一行的次序向北數(shù)、第三行和第四行順次進(jìn)行)，共計(jì)20株設(shè)置為一小區(qū)，重復(fù)3次，總計(jì)60株。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 環(huán)境因子測(cè)定 于果實(shí)轉(zhuǎn)色前每小區(qū)中間部位放置兩個(gè)溫濕度及光照記錄儀，懸掛于植株中部外測(cè)5～10 cm處，待果實(shí)總體轉(zhuǎn)色完成后取下記錄儀，數(shù)據(jù)用于設(shè)施環(huán)境因子分析。

1.3.2 藍(lán)莓果實(shí)樣品采集 根據(jù)試驗(yàn)區(qū)內(nèi)藍(lán)莓果實(shí)總體轉(zhuǎn)色情況，分別于轉(zhuǎn)色初期、花盤(pán)轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色中期、轉(zhuǎn)色后期、轉(zhuǎn)色完成期采摘果實(shí)樣品，每個(gè)品種每小區(qū)采集50粒，帶回實(shí)驗(yàn)室后液氮冷凍，存于－80℃冰箱供相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。轉(zhuǎn)色期各階段果實(shí)采集標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)圖1。

圖1 試驗(yàn)材料采收標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 花色苷含量及其代謝相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 藍(lán)莓果實(shí)花色苷含量參照張美嬌等[22]的方法測(cè)定。總RNA提取參照鄭嘉偉等[23]的方法，利用北京康為試劑公司的UltraSYBR Mixture進(jìn)行qRT－PCR檢測(cè)，相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)引物序列如表1所示。基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)均以各品種轉(zhuǎn)色初期的表達(dá)量為對(duì)照。

表1 藍(lán)莓花色苷代謝相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)的引物及序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及作圖，采用DPS 7.05進(jìn)行方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期花色苷含量變化動(dòng)態(tài)

由圖2可見(jiàn)，奧尼爾的花色苷總量在轉(zhuǎn)色初期至花盤(pán)轉(zhuǎn)色期均較低，變化不顯著；轉(zhuǎn)色中期始花色苷快速積累，含量增加顯著，為花盤(pán)轉(zhuǎn)色期的5.30倍；轉(zhuǎn)色后期花色苷含量為轉(zhuǎn)色中期的3.38倍，至轉(zhuǎn)色完成期，花色苷含量達(dá)5.95 mg/kg，比轉(zhuǎn)色后期顯著提升30.86%。米斯蒂的花色苷快速積累期稍有延后，轉(zhuǎn)色中期前積累很少，含量變化不顯著；轉(zhuǎn)色后期花色苷快速積累至3.00 mg/kg，為轉(zhuǎn)色中期的8.82倍，至轉(zhuǎn)色完成期花色苷含量達(dá)到5.03 mg/kg。由此可見(jiàn)，奧尼爾的花色苷快速積累期在花盤(pán)轉(zhuǎn)色期至轉(zhuǎn)色后期，米斯蒂的快速積累期則在轉(zhuǎn)色中期至轉(zhuǎn)色后期；奧尼爾的花色苷快速積累持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，轉(zhuǎn)色完成時(shí)，花色苷含量也更高。

圖2 兩種藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期花色苷含量變化動(dòng)態(tài)

2.2 兩種藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期花色苷代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量變化

2.2.1 奧尼爾的相關(guān)基因表達(dá)量變化 對(duì)奧尼爾花色苷代謝途徑相關(guān)基因不同時(shí)期表達(dá)量分析可見(jiàn)(圖3)，花色苷合成基因VcPAL、VcCHS、Vc-CHI、VcANS、VcUFGT表達(dá)量在整個(gè)測(cè)定期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，轉(zhuǎn)色中期表達(dá)量驟升為花盤(pán)轉(zhuǎn)色期的2.77～3.63倍，其中，VcPAL、VcCHS、VcANS和VcUFGT表達(dá)量在轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期依舊顯著上升，即合成酶繼續(xù)發(fā)揮合成作用。VcF3H和VcDFR表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中，VcF3H在轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量最高，轉(zhuǎn)色完成期表達(dá)量顯著下降至轉(zhuǎn)色后期的45.32%；VcDFR表達(dá)量則在轉(zhuǎn)色中期達(dá)最高峰，轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期表達(dá)量分別顯著下降4.59%、20.51%。氧化酶基因VcGLH和VcPPO表達(dá)量在整個(gè)轉(zhuǎn)色期均較低，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)色初期較高、之后下降、轉(zhuǎn)色完成期再顯著回升的趨勢(shì)，其中，VcGLH表達(dá)量在花盤(pán)轉(zhuǎn)色期比轉(zhuǎn)色初期顯著下降79.39%，花盤(pán)轉(zhuǎn)色期至轉(zhuǎn)色后期無(wú)顯著變化，轉(zhuǎn)色完成期顯著提升至轉(zhuǎn)色后期的2.08倍；VcPPO的表達(dá)量在轉(zhuǎn)色初期至花盤(pán)轉(zhuǎn)色期有所降低，但差異不顯著，轉(zhuǎn)色中期顯著下降52.32%，轉(zhuǎn)色后期與轉(zhuǎn)色中期水平相當(dāng)，轉(zhuǎn)色完成期驟升至轉(zhuǎn)色后期的6.83倍。

圖3 奧尼爾藍(lán)莓轉(zhuǎn)色期花色苷代謝相關(guān)酶的基因相對(duì)表達(dá)量動(dòng)態(tài)分析

可 見(jiàn)，奧 尼 爾 的VcPAL、VcCHS、VcCHI、VcANS、VcUFGT等合成酶基因在果實(shí)轉(zhuǎn)色期持續(xù)發(fā)揮作用，且表達(dá)量較高，而氧化酶基因VcGLH、VcPPO在整個(gè)轉(zhuǎn)色期表達(dá)量均較低，尤其合成酶基因表達(dá)高峰期極低，這更利于果實(shí)花色苷的合成與積累。

2.2.2 米斯蒂的相關(guān)基因表達(dá)量變化 對(duì)米斯蒂花色苷代謝途徑相關(guān)基因不同時(shí)期表達(dá)量分析可見(jiàn)(圖4)，VcPAL、VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)色中后期表達(dá)量驟升，轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量最高，而VcUFGT僅在轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量驟升；至轉(zhuǎn)色完成期上述基因的表達(dá)量又顯著下降82.00%～91.30%，與花盤(pán)轉(zhuǎn)色期的表達(dá)量相當(dāng)。VcANS的表達(dá)量在花盤(pán)轉(zhuǎn)色期顯著升高至轉(zhuǎn)色初期的8.25倍，之后表達(dá)量無(wú)顯著變化。VcGLH和VcPPO相較于其他基因，表達(dá)量一直處于較低水平。

圖4 米斯蒂藍(lán)莓花色苷代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量動(dòng)態(tài)分析

由此可見(jiàn)，米斯蒂各基因的表達(dá)趨勢(shì)一致性較強(qiáng)，且調(diào)控花色苷合成的基因表達(dá)高峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色中期和轉(zhuǎn)色后期，以轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量更高，轉(zhuǎn)色完成時(shí)，各基因的相對(duì)表達(dá)量與花盤(pán)轉(zhuǎn)色期水平相當(dāng)，但VcANS的相對(duì)表達(dá)量在花盤(pán)轉(zhuǎn)色期上升后，一直保持在轉(zhuǎn)色初期的17倍左右。

2.3 果實(shí)微環(huán)境對(duì)花色苷積累的影響

2.3.1 光照 從轉(zhuǎn)色期光照強(qiáng)度(圖5)來(lái)看，4月11日至21日設(shè)施大棚內(nèi)的光照強(qiáng)度主要集中在20～40 klx，最強(qiáng)光照為40～60 klx，最高達(dá)65.25 klx，此時(shí)大部分藍(lán)莓果實(shí)處于轉(zhuǎn)色初期；4月22日至25日光照強(qiáng)度顯著下降，大多在10 klx左右，最大光照強(qiáng)度為46.40 klx；4月26日至5月1日光照強(qiáng)度波動(dòng)較大，主要分布在10～40 klx，但出現(xiàn)超過(guò)60 klx的強(qiáng)光照天氣數(shù)增多，即轉(zhuǎn)色中后期光照強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)。

圖5 藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期光照強(qiáng)度動(dòng)態(tài)分析

2.3.2 氣溫 由圖6可見(jiàn)，4月11日至21日，設(shè)施內(nèi)氣溫相對(duì)穩(wěn)定，大部分維持在15～35℃，溫差較?。?月26日以后，棚內(nèi)溫差較大，氣溫波動(dòng)較大，35℃以上高溫和10℃以下低溫同日出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)5℃以下低溫。即藍(lán)莓花盤(pán)轉(zhuǎn)色期棚內(nèi)溫差較小，轉(zhuǎn)色中后期溫度相對(duì)穩(wěn)定，后期晝夜溫差增大，促進(jìn)花色苷合成與積累。由日平均溫度曲線(xiàn)可見(jiàn)，設(shè)施內(nèi)日平均溫度維持在15～25℃，前期維持在20～25℃，后期降至15～20℃。

圖6 藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期氣溫變化動(dòng)態(tài)

2.3.3 空氣濕度 從圖7來(lái)看，設(shè)施內(nèi)空氣濕度大部分在10%以上，4月25日左右濕度全天較高，維持在50%以上，即果實(shí)轉(zhuǎn)色中期生長(zhǎng)環(huán)境濕度較大，這有利于減少光合產(chǎn)物消耗及為花色苷代謝提供充分的底物；4月28日以后濕度未達(dá)到100%，且10%及以下濕度出現(xiàn)幾率增加，5月2日至4日濕度波動(dòng)范圍較小，最高濕度在70%左右。

圖7 藍(lán)莓果實(shí)轉(zhuǎn)色期空氣濕度變化動(dòng)態(tài)

綜合氣象數(shù)據(jù)可見(jiàn)，棚內(nèi)前期光照較弱、平均氣溫較高且溫差較小、空氣濕度較大，適宜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，以便為花色苷合成提供充分的底物；后期光照相對(duì)較強(qiáng)，平均溫度較低、溫差較大、濕度較小、光照較強(qiáng)，加之前期的底物累積，更利于果實(shí)花色苷合成。

3 討論與結(jié)論

品種是影響花色苷含量的重要因素，直接決定花色苷基因型[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，引種的南高叢藍(lán)莓品種奧尼爾和米斯蒂在膠東地區(qū)設(shè)施栽培時(shí)的花色苷積累規(guī)律不同，奧尼爾的花色苷合成呈穩(wěn)定增長(zhǎng)模式，而米斯蒂的花色苷合成屬于激增式。奧尼爾花色苷代謝相關(guān)基因中，前端合成基因VcPAL、VcCHS、VcCHI及后端合成基因VcANS、VcUFGT的相對(duì)表達(dá)量在果實(shí)轉(zhuǎn)色前期至后期逐步升高，且在轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期的基因表達(dá)量增幅較高，合成中端基因VcF3H和VcDFR表達(dá)量先升高再降低，VcGLH、VcPPO表達(dá)量先降低再升高，這與花色苷在轉(zhuǎn)色中期開(kāi)始大量累積趨勢(shì)一致。米斯蒂花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)色前期和花盤(pán)轉(zhuǎn)色期均較為平穩(wěn)，轉(zhuǎn)色中期至轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量激增，之后又?jǐn)嘌率较碌?，這與花色苷含量在轉(zhuǎn)色后期大量積累的規(guī)律一致。兩個(gè)藍(lán)莓品種花色苷代謝相關(guān)基因表達(dá)量的差異可能是由品種差異造成的，也可能是由于不同品種的基因表達(dá)對(duì)外界因素如溫度、濕度及光照等的響應(yīng)不同[25]。通過(guò)對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)環(huán)境的氣溫、濕度及光照強(qiáng)度分析可見(jiàn)，花色苷合成的不同階段其外界條件不同，前期棚內(nèi)日平均氣溫較高、溫差較小、濕度較大、光照強(qiáng)度相對(duì)較低，可能更適合奧尼爾花色苷相關(guān)基因的表達(dá)；而中后期，棚內(nèi)日平均溫度下降、溫差較大、濕度下降、光照強(qiáng)度增大，可能更適合米斯蒂花色苷相關(guān)基因的表達(dá)。

綜合上述分析，米斯蒂的花色苷基因表達(dá)高峰期稍晚，集中表達(dá)特點(diǎn)更為顯著，但奧尼爾花色苷總量在整個(gè)轉(zhuǎn)色過(guò)程中均高于米斯蒂。造成這種差異的原因首先可能是品種間差異，其次可能是米斯蒂合成途徑中的VcANS表達(dá)量相對(duì)較低，限制了花色苷的合成[26]。