杜佳，金桂勇，陳芝飛，鄭峰洋，羅燦選，宋偉民，張曉平，劉鵬飛，席高磊

(1.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450016；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/河南省香精香料與調(diào)香工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

植物多糖亦稱植物多聚糖，是植物代謝過(guò)程中聚合而成的天然高分子聚合物，起到維持植物正常生命活動(dòng)的功能[1]。大量研究表明植物多糖具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[4]和抗病毒[5]等生理和藥理活性，并且無(wú)毒無(wú)害，是醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[6]開(kāi)發(fā)產(chǎn)品的重要原料。目前科研工作者已將人參多糖[7]、黃芪多糖[8]和枸杞多糖[9]等制成注射液或膠囊廣泛用于臨床治療和保健品[10]。

藍(lán)莓多糖是指從藍(lán)莓鮮果、葉或果渣等原料中提取出來(lái)的植物多糖[11]。已有提取方法包括微波輔助法、超聲輔助法、熱水浸提法和酶法[12－15]。但這些方法仍存在一定局限性，比如微波輔助法和超聲輔助法在提高多糖提取率的同時(shí)會(huì)改變多糖微觀結(jié)構(gòu)，影響多糖活性[16]；酶法成本較高，對(duì)提取條件較為苛刻[17]。熱水浸提法對(duì)設(shè)備需求較低，操作簡(jiǎn)單，備受關(guān)注。朱金艷等[18]采用熱水浸提法對(duì)藍(lán)莓果渣中多糖進(jìn)行提取，并用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但提取率仍較低，且未系統(tǒng)研究藍(lán)莓多糖的抗氧化活性。因此，進(jìn)一步優(yōu)化提取技術(shù)，提高提取率，仍是今后實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓果渣多糖高效利用的重要基礎(chǔ)。

本研究以藍(lán)莓果渣為原料，選用熱水浸提法提取藍(lán)莓多糖，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)抑制自由基氧化DNA反應(yīng)和淬滅自由基反應(yīng)系統(tǒng)研究藍(lán)莓果渣粗多糖和精多糖的抗氧化活性，以期為藍(lán)莓果渣多糖的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要儀器與試劑

藍(lán)莓果渣，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。N－1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、NVP－10006A型循環(huán)水真空泵(上海愛(ài)郎有限公司)，LYOVAC GT2型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)SRK公司)，F(xiàn)A2004型分析天平(上海上平儀器有限公司)，UV－1800PC紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科學(xué)儀器有限公司)。

氯仿、磷酸、無(wú)水乙醇:分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2－硫代巴比妥酸(TBA):分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核酸鈉鹽(DNA)、2，2’－偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH):標(biāo)準(zhǔn)品，ACROS ORGANICS公司；還原型谷胱甘肽(GSH)、四氯氫醌(TCHQ):分析純，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO):分析純，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司；2，2’－偶氮－雙－(3－乙基苯并噁唑啉－6－磺酸)二銨鹽自由基(ABTS·＋)、二苯苦味酰肼自由基(DPPH·)、2，6－二叔丁基－(3，5－二叔丁基－4－氧代－2，5－環(huán)己二烯)－對(duì)－甲苯氧自由基(Galvinoxyl·):標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma－Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓果渣多糖的提取 參考文獻(xiàn)[18]的方法:藍(lán)莓果渣經(jīng)無(wú)水乙醇脫脂2 h后，于55°C烘箱干燥72 h，粉碎過(guò)60目篩，得藍(lán)莓果渣干粉。稱取2.00 g藍(lán)莓果渣干粉，加一定體積蒸餾水，在一定溫度下提取一定時(shí)間，提取兩次，提取液4000 r/min離心10 min，上清液即為藍(lán)莓果渣多糖溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及多糖得率測(cè)定 配制40 μg/mL的葡萄糖工作液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL工作液于10 mL試管，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，分別加1 mL 5%苯酚溶液和3 mL硫酸，搖晃均勻，冷至室溫后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝0.0138x＋0.2452，R2＝0.9990。式中:A為吸光值；x為濃度，μg/mL。取適量藍(lán)莓果渣多糖溶液，按下述公式計(jì)算多糖得率:

式中:C為稀釋后多糖濃度，μg/mL；V1為多糖提取液體積，mL；V2為測(cè)試的樣品體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為藍(lán)莓果渣干粉質(zhì)量，μg。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 稱取2.00 g藍(lán)莓果渣干粉，固定提取2次，提取時(shí)間5 h，提取溫度70℃，考察不同液料比(30、40、50、60、70 mL/g)對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響。

稱取2.00 g藍(lán)莓果渣干粉，固定提取2次，提取時(shí)間5 h，液料比60 mL/g，考察不同提取溫度(50、60、70、80、90℃)對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響。

稱取2.00 g藍(lán)莓果渣干粉，固定提取2次，提取溫度70℃，液料比60 mL/g，考察不同提取時(shí)間(2、3、4、5、6 h)對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以藍(lán)莓果渣多糖得率為響應(yīng)值Y，以液料比(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)為變量因子，因子編碼和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子和水平

1.2.5 藍(lán)莓果渣粗多糖的純化 藍(lán)莓果渣多糖溶液濃縮至原體積1/5，加無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，4℃冰箱過(guò)夜，4000 r/min離心后取沉淀物凍干得藍(lán)莓果渣粗多糖。采用文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)藍(lán)莓果渣粗多糖進(jìn)行脫蛋白、脫色和透析等操作后得藍(lán)莓果渣精多糖。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)試 采用文獻(xiàn)[20]的方法對(duì)藍(lán)莓果渣粗多糖和精多糖進(jìn)行抑制AAPH、GS·和HO·引發(fā)的DNA氧化反應(yīng)測(cè)試。多糖濃度為6 mg/mL。

1.2.7 淬滅自由基性能測(cè)試 分別配制1、2、3、4、5、6 mg/mL的多糖溶液，VC為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS·＋清除試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行，DPPH·清除試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行，Galvinoxyl·清除試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[23]的方法稍加修改。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均設(shè)3次平行。用Design－Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多糖提取工藝優(yōu)化，用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。顯著性檢驗(yàn)方法為Duncan’s多重比較，顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響 增加溶劑能夠提高液料間的多糖濃度梯度差，導(dǎo)致液相傳質(zhì)動(dòng)力變大，有利于多糖的溶出[24]。從圖1可知，當(dāng)液料比從30 mL/g增加到50 mL/g時(shí)，藍(lán)莓果渣多糖得率顯著增加，在液料比60 mL/g時(shí)達(dá)到最大值1.93%。但繼續(xù)提升液料比，藍(lán)莓果渣多糖得率有所降低，這可能是因?yàn)槿軇┻^(guò)多時(shí)溶出較多雜質(zhì)，從而影響多糖的溶出[25]。另外，液料比過(guò)大會(huì)浪費(fèi)溶劑且不利于回收。因此選擇液料比60 mL/g為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心值。

圖1 液料比對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響 從圖2可知，隨提取溫度的升高，藍(lán)莓果渣多糖得率先升高后略有降低。升高溫度有利于細(xì)胞破碎，促使多糖溶出[26]。當(dāng)提取溫度升至80℃時(shí)，藍(lán)莓果渣多糖得率達(dá)到最大值2.23%，繼續(xù)升高則有所下降。這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致部分多糖分解，從而降低多糖得率[27]。因此選擇80℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心值。

圖2 提取溫度對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響 從圖3可看出，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓果渣多糖得率呈現(xiàn)先迅速上升而后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。提取時(shí)間從2 h增加到4 h，藍(lán)莓果渣多糖得率顯著增加，提取時(shí)間為5 h時(shí)達(dá)到最大值2.13%，而繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間可能導(dǎo)致多糖降解或雜質(zhì)溶出，影響多糖得率[27]。因此，選擇5 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心值。

圖3 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)軟件Design－Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)分析，3因素?cái)M合得到的回歸方程為:Y＝2.326－0.0125A＋0.02375B＋0.08125C－0.065AB－0.07AC－0.0725BC－0.18425A2－0.21675B2－0.14175C2。模型P<0.01，表明該模型極顯著，試驗(yàn)可靠。模型決定系數(shù)R2＝0.9135，擬合度較高，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)的擬合程度較好，說(shuō)明上述回歸方程可用于藍(lán)莓果渣多糖提取的分析與優(yōu)化。由F值可知，各因素對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>提取溫度>液料比。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸系數(shù)的顯著性分析

2.2.2 因素間交互作用結(jié)果 響應(yīng)面圖和等高線圖反映了液料比、提取溫度和提取時(shí)間兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面曲面越陡峭、等高線圖越接近橢圓，說(shuō)明兩因素間交互作用越強(qiáng)，反之越弱。由圖4(A)可知，當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，液料比與提取溫度的交互曲面較為陡峭，而等高線近似圓形，表現(xiàn)為不顯著；由圖4(B)和圖4(C)可知，提取溫度與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間兩組交互作用的曲面均較為平緩，等高線均近似圓形，交互作用也并不顯著。同時(shí)，影響多糖得率最顯著的因素是提取時(shí)間，表現(xiàn)為其響應(yīng)面的弧度最大，其次為提取溫度和液料比，與表3結(jié)果一致。優(yōu)化得到的最佳提取工藝為:液料比59.04 mL/g、提取溫度80.18℃、提取時(shí)間5.30 h，在此條件下藍(lán)莓果渣多糖得率為2.34%。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)曲面和等高線圖

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)2.2.2所得結(jié)論，選取液料比59 mL/g、提取溫度80℃、提取時(shí)間5.30 h，進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，所得多糖提取率平均值為2.33%，與2.2.2節(jié)所得理論值基本吻合，進(jìn)一步說(shuō)明該回歸方程能夠較真實(shí)反映各因素對(duì)多糖得率的影響。

2.3 抗氧化活性測(cè)試

2.3.1 抑制AAPH氧化DNA結(jié)果分析 在AAPH氧化DNA體系中，以加0.1 mL蒸餾水為空白組，加0.1 mL多糖溶液為測(cè)試組，測(cè)得的TBARS吸光度值分別為A空白和A多糖。空白組TBARS百分?jǐn)?shù)為100%，多糖抗氧化能力可采用相對(duì)于空白組吸光度值的百分?jǐn)?shù)(TBARS百分?jǐn)?shù))進(jìn)行衡量[28]，TBARS百分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為TBARS百分?jǐn)?shù)(%)＝(A多糖/A空白)×100。

如圖5所示，藍(lán)莓果渣粗多糖和精多糖的TBARS百分?jǐn)?shù)均低于空白組的100%，說(shuō)明粗多糖和精多糖均具有抑制AAPH引起DNA氧化的能力。其中，粗多糖的TBARS百分?jǐn)?shù)為90.38%，低于精多糖的94.97%，說(shuō)明粗多糖的抑制能力較精多糖強(qiáng)。這表明，藍(lán)莓果渣粗多糖經(jīng)純化后其抑制AAPH引起DNA氧化的能力降低。

2.3.2 抑制GS·氧化DNA結(jié)果分析 參考2.3.1中的方法求得多糖抑制GS·氧化DNA的TBARS百分?jǐn)?shù)。如圖5所示，粗多糖和精多糖的TBARS百分?jǐn)?shù)分別為87.48%和91.41%，均小于空白的100%，說(shuō)明兩者均可抑制GS·氧化DNA，且粗多糖的抑制能力更強(qiáng)，強(qiáng)于文獻(xiàn)報(bào)道的水溶性維生素E(TBARS百分?jǐn)?shù)為88.30%)[29]。這一結(jié)果與2.3.1中的結(jié)論一致，同樣說(shuō)明純化過(guò)程降低了多糖的抗氧化性能。另外，粗多糖和精多糖抑制GS·氧化DNA的TBARS百分?jǐn)?shù)均低于相應(yīng)抑制AAPH氧化DNA的體系，說(shuō)明兩者抑制GS·引起DNA氧化的能力更強(qiáng)。

2.3.3 抑制HO·氧化DNA結(jié)果分析 參考2.3.1中的方法求得藍(lán)莓果渣多糖TBARS百分?jǐn)?shù)。如圖5所示，粗多糖的TBARS百分?jǐn)?shù)為94.36%，小于精多糖的TBARS百分?jǐn)?shù)(97.70%)，但均低于空白的100%，表明粗多糖和精多糖均能夠抑制HO·氧化DNA，具有抗氧化的性能，粗多糖抗氧化能力大于精多糖。而且兩者的TBARS百分?jǐn)?shù)均高于相應(yīng)抑制AAPH和GS·氧化DNA體系，說(shuō)明其抑制HO·氧化DNA的能力弱于上述兩種體系。

圖5 藍(lán)莓果渣多糖抑制AAPH、GS·和HO·引發(fā)DNA氧化反應(yīng)的TBARS百分?jǐn)?shù)

2.4 抑制清除自由基性能

2.4.1 清除ABTS·＋性能分析 ABTS被氧化成ABTS·＋后其顏色變?yōu)樗{(lán)綠色，當(dāng)抗氧化劑與其孤對(duì)電子配對(duì)后變?yōu)闊o(wú)色，因此可通過(guò)顏色變化來(lái)評(píng)估清除ABTS·＋能力。由圖6可知，粗多糖和精多糖均具有清除ABTS·＋的能力，且隨著濃度的增加，其清除能力明顯增強(qiáng)，表明兩者的質(zhì)量濃度與ABTS·＋清除率呈量效關(guān)系。在多糖濃度為6 mg/mL時(shí)，粗多糖和精多糖的ABTS·＋清除率分別為68.85%和54.42%，說(shuō)明粗多糖的清除能力明顯強(qiáng)于精多糖，但與VC相比仍有差距。

圖6 多糖的ABTS·＋清除率

2.4.2 清除DPPH·性能分析 由圖7可知，粗多糖和精多糖均能夠清除DPPH·，且隨著多糖濃度的增加，DPPH·清除率逐漸增大，粗多糖的DPPH·清除率始終大于精多糖。在多糖濃度為6 mg/mL時(shí)，粗多糖和精多糖的DPPH·清除率分別為23.53%和16.87%，但均明顯低于VC，說(shuō)明純化過(guò)程降低了藍(lán)莓果渣多糖清除DPPH·的能力。

圖7 多糖的DPPH·清除率

2.4.3 清除Galvinoxyl·性能分析 Galvinoxyl·是一種C－中心自由基，在乙醇溶液中顯淡黃色，最大吸收波長(zhǎng)為428 nm。如圖8所示，隨著多糖濃度的增加，粗多糖和精多糖的Galvinoxyl·清除率增加趨勢(shì)較弱，在多糖濃度為6 mg/mL時(shí)，兩者的Galvinoxyl·清除率分別為13.39%和11.58%，粗多糖清除率略高于精多糖，但明顯低于VC。

圖8 多糖的Galvinoxyl·清除率

3 討論與結(jié)論

3.1 藍(lán)莓果渣多糖提取工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)表明提取時(shí)間和提取溫度都不宜過(guò)高，超過(guò)閾值會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致得率降低，與魏增云等[27]的研究結(jié)果一致；隨液料比的增大，多糖得率呈先增加后降低的趨勢(shì)，在液料比為60 mL/g時(shí)多糖得率最大。這是因?yàn)橐毫媳容^小時(shí)多糖不能充分溶出，而液料比過(guò)大時(shí)雜質(zhì)會(huì)逐漸溶出，不僅影響多糖的溶出速率，而且降低了多糖純度。進(jìn)一步采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)研究提取溫度、時(shí)間和液料比對(duì)藍(lán)莓果渣多糖得率的影響，結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響最大，提取溫度次之，液料比影響最?。桓饕蛩刂g交互作用并不顯著。綜上，藍(lán)莓果渣多糖的最佳提取工藝為液料比59 mL/g、提取溫度80℃、提取時(shí)間5.30 h，在此條件下多糖得率為2.33%。朱金艷等[18]通過(guò)正交試驗(yàn)得出藍(lán)莓果渣多糖提取參數(shù)為:液料比60 mL/g、溫度90℃、時(shí)間4 h，藍(lán)莓果渣多糖得率為2.108%。與之相比，本試驗(yàn)的提取溫度更低、節(jié)省能源且易于控制，多糖得率也有所增加，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

3.2 藍(lán)莓果渣多糖抗氧化性能評(píng)價(jià)

6個(gè)抗氧化體系研究結(jié)果顯示，粗多糖和精多糖均能有效抑制自由基、氧化DNA和清除自由基且粗多糖的抗氧化能力優(yōu)于精多糖。這與陳琳等[30]的研究結(jié)果一致，其原因可能是粗多糖在純化過(guò)程中，某些非糖的抗氧化物質(zhì)被除去，而這類物質(zhì)的抗氧化性能遠(yuǎn)高于多糖。再如，楊燕敏[31]對(duì)哈密大棗多糖提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)粗多糖的多酚類物質(zhì)未完全除去，導(dǎo)致其ABTS·＋清除率高于精多糖。龔雯等[32]研究發(fā)現(xiàn)，金花茶多糖的結(jié)構(gòu)不同也會(huì)影響多糖的抗氧化能力，β－吡喃糖構(gòu)型的金花茶多糖HO·清除率與VC相似，因此，純化前后藍(lán)莓果渣多糖抗氧化能力的改變也可能是因?yàn)槎嗵堑慕Y(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。但另有研究表明，粗多糖經(jīng)純化后，抗氧化能力增強(qiáng)，這可能是因?yàn)榇侄嗵墙?jīng)純化后多糖含量提升而導(dǎo)致自由基清除能力增強(qiáng)。綜上，多糖的抗氧化能力與多種因素有關(guān)，如多糖的純度、結(jié)構(gòu)、單糖組成等[33，34]，而有關(guān)藍(lán)莓果渣多糖純化前后抗氧化性能的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究結(jié)果可為藍(lán)莓果渣的合理利用提供理論參考，另外有關(guān)純化前后粗多糖和精多糖的結(jié)構(gòu)、單糖組成及其與抗氧化性能之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。