劉紅艷，張 晗，孫秀娟，李艷杰，王春艷，顏 勇

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000 2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000 3.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

我國(guó)已步入老齡化社會(huì)，60歲以上的老齡人今年 已達(dá)1.85億，明年將突破2億。延年益壽，抗衰老提高老年人的生活質(zhì)量迫在眉睫。既往抗衰老的研究多集中在心、腦、血管方面，在眼、生殖系統(tǒng)方面也多見(jiàn)報(bào)道［1，2］。但有關(guān)松花粉預(yù)防和延緩腮腺衰老作用的研究國(guó)內(nèi)甚少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同劑量松花粉，對(duì)D－半乳糖所致亞急性衰老大鼠腮腺組織IGF－1的表達(dá)進(jìn)行研究，觀察松花粉對(duì)衰老大鼠腮腺功能的影響，探討松花粉預(yù)防和延緩腮腺組織衰老作用的機(jī)制，為篩選抗腮腺衰老中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠90只(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)。體重180－220g，隨機(jī)分成9組，正常組(10只);松花粉預(yù)防組(中、低劑量組各10只);模型組(10只)，松花粉延緩衰老組(高、中、低劑量組各10只)，陰性對(duì)照組(10只)，VE陽(yáng)性對(duì)照組(10只)。

1.2 方 法

1.2.1 藥品與試劑：松花粉購(gòu)于中國(guó)新時(shí)代集團(tuán)，D－半乳糖購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，IGF－1檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司。

1.2.2 模型建立：SD大鼠按200mg·kg－1·d－1腹腔注射D－半乳糖(用生理鹽水配成5%的溶液)，除正常組外，其余各組均連續(xù)用藥50d，每天1次，制備亞急性衰老動(dòng)物模型。

1.2.3 用藥方法：松花粉用1%羧甲基纖維素鈉稀釋，高、中、低劑量分別按1400、700、350 mg·kg－1·d－1灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組用維生素E按35 mg·kg－1·d－1灌胃給藥。預(yù)防組在注射D－半乳糖的同時(shí)灌胃松花粉，連續(xù)50d，每日1次。延緩衰老組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組大鼠在造模成功后每天灌胃松花粉、維生素E和生理鹽水，連續(xù)50d，每日1次。

1.2.4 IGF－1表達(dá)的檢測(cè)：將正確取材常規(guī)固定、包埋的腮腺組織塊連續(xù)切片，常規(guī)做免疫組織化學(xué)染色(SP法)，顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿染成棕黃色粗顆粒或細(xì)顆粒彌散分布為陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。定量數(shù)據(jù)處理：用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本檢查3張切片，每張切片檢查10個(gè)高倍視野，隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的部位，每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算免疫陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：將IGF－1檢測(cè)結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用t檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

IGF－1的表達(dá)：模型組表達(dá)量明顯減少，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)，與陰性對(duì)照組、松花粉延緩衰老高劑量組接近(P＞0.05)，而松花粉預(yù)防中劑量組和松花粉延緩衰老中、低劑量組IGF－1的表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)(圖1，2，3)其中松花粉預(yù)防中劑量組表達(dá)效果最顯著。松花粉延緩衰老中劑量組的效果又好于延緩衰老高、低劑量組、VE陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠腮腺I(mǎi)GF-1在導(dǎo)管細(xì)胞中的表達(dá)(±s，n=10)

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠腮腺I(mǎi)GF-1在導(dǎo)管細(xì)胞中的表達(dá)(±s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，2)P＞0.05;與預(yù)防中劑量組比較：3)P＜0.01，與延緩衰老中劑量組比較4)P＜0.05

組別 IGF－1陽(yáng)性細(xì)胞百分率(%)正常組 30.11±2.151)模型組 6.43±1.80預(yù)防低劑量組 28.61±3.121)3)預(yù)防中劑量組 58.39±2.721)3)延緩衰老低劑量組 26.52±1.871)3)4)延緩衰老中劑量組 40.34±2.241)3)4)延緩衰老高劑量組 15.85±3.182)4)陽(yáng)性對(duì)照組 23.97±1.75 4)陰性對(duì)照組 12.19±1.362)

圖1 預(yù)防中劑量組IGF－1的表達(dá)(200×)

圖2 延緩衰老低劑量組IGF－1的表達(dá)(200×)

圖3 延緩衰老中劑量組IGF－1的表達(dá)(200×)

圖1－圖4顯示：在同一高倍鏡(200×)下，松花粉預(yù)防中劑量組、松花粉延緩衰老組(低、中、高劑量)IGF－1在腮腺導(dǎo)管細(xì)胞中的表達(dá)情況。其中松花粉預(yù)防中劑量組IGF－1表達(dá)陽(yáng)性率最高，其次是松花粉延緩衰老中劑量組、松花粉延緩衰老低劑量組、松花粉延緩衰老高劑量組。

圖4 延緩衰老高劑量組IGF－1的表達(dá)(200×)

3 討論

衰老模型的選擇：本研究依照劉學(xué)麗［3］等報(bào)道對(duì)SD大鼠以腹腔注射方式給藥，并應(yīng)用D－半乳糖成功建立了D－半乳糖誘發(fā)的亞急性衰老動(dòng)物模型［4］，使得各實(shí)驗(yàn)組同等起始，具有良好的可比性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠。

松花粉的抗衰老作用：松花粉藥名松黃，作為傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫(kù)中的傳統(tǒng)藥材，在古代文獻(xiàn)中早有記載。松花粉含有20種氨基酸(8種人體必需氨基酸)，14種維生素，30種礦物質(zhì)等，數(shù)量達(dá)200余種。有研究報(bào)道松花粉能夠有效降低血脂，促進(jìn)鋅的吸收利用［5］;松花粉作用于人肺成纖維細(xì)胞能明顯促進(jìn)細(xì)胞群體倍增水平，降低細(xì)胞死亡數(shù)目［6］。此外Giovannini［7］等研究顯示，增齡可使血液中IGF－1濃度降低。健康的老年人血液中IGF－1水平較年輕人低30%－40%。

本研究經(jīng)觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠腮腺I(mǎi)GF－1在導(dǎo)管細(xì)胞中的表達(dá)情況，用免疫組織化學(xué)方法(SP法)證實(shí)大鼠腮腺組織IGF－1廣泛表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物位于腮腺導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿中。結(jié)果表明：松花粉預(yù)防用藥的效果優(yōu)勢(shì)明顯，其中預(yù)防中劑量組效果最佳;松花粉延緩衰老中劑量組的效果明顯好于延緩衰老高、低劑量組、VE陽(yáng)性對(duì)照組，其中松花粉延緩衰老高劑量組效果最差。本研究提示松花粉能提高腮腺導(dǎo)管細(xì)胞IGF－1的表達(dá)，證實(shí)松花粉能促進(jìn)腮腺導(dǎo)管細(xì)胞分泌IGF－1，對(duì)預(yù)防和延緩腮腺組織衰老具有調(diào)節(jié)作用;針對(duì)松花粉抗衰老預(yù)防用藥，臨床我們提倡應(yīng)用中劑量為佳。

［1］ 吳賽珠，譚家余，周忠江，等.性激素通過(guò)影響血脂、細(xì)胞免疫功能及氧化/抗氧化系統(tǒng)影響衰老［J］.嶺南心血管病雜志，2004，10(1)：10－16.

［2］ 牛嗣云，龐曉靜，陳龍，等.松花粉對(duì)亞急性衰老模型大鼠抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2005，25(12)：1504－1506.

［3］ 劉學(xué)麗，朱延勤，潘偉娜，等.對(duì)大鼠半乳糖性白內(nèi)障實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶接懀跩］.北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，1994，11(2)：2－3.

［4］ 顧以芍.實(shí)驗(yàn)性D－半乳糖誘發(fā)動(dòng)物白內(nèi)障造膜的探討［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1987，(1)：12－16.

［5］ 趙霖，鮑善芬，U Eidelsbutg，等.松花粉對(duì)缺鋅幼鼠營(yíng)養(yǎng)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2000，22(1)：14－17.

［6］ 趙立新，喻陸.松花粉對(duì)人肺成纖維細(xì)胞增殖活性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23(2)：79－81.

［7］ Giovannini S，Marzetti E，Borst SE，et al.Modulation of GH/IGF－1axis：Potential strategies to counteract sarcopenia in older adults［J］.Mech Ageing Dev，2008，129(10)：593.