何秀云 朱傳智 逄宇 黃香玉 蔣麗氣 趙雁林 莊玉輝

目前，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis Mtb）H37Rv全基因組序列已知，但許多蛋白質(zhì)功能仍不清楚。Mtb耐藥機(jī)制、致病機(jī)制研究還有待于揭示更多Mtb蛋白功能。雖然，目前治療結(jié)核病依然采用利福平（RFP）、異煙肼（INH）、鏈霉素（S）和吡嗪酰胺（PZA）的聯(lián)合化療，但RFP、INH和S耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)INH耐藥的分子診斷標(biāo)識(shí)有katG，inhA，kasA，oxyR-ahpC 間隔區(qū)突變，但仍有高達(dá)40%的耐INH菌株不能檢測(cè)到上述基因突變［1］。編碼核糖體S12蛋白的rpsL 基因突變（K43R，K88Q）是S耐藥的主要分子標(biāo)識(shí)，其次是編碼16SrRNA的rrs基因突變（530莖環(huán)和915位核苷酸）［2］。但仍有約30%S耐藥結(jié)核分枝桿菌未檢測(cè)到rpsL或rrs基因突變，推測(cè)結(jié)核分枝桿菌S耐藥還存在其他機(jī)制［3］。

宿主免疫功能和感染的Mtb毒力強(qiáng)弱決定了機(jī)體感染Mtb的結(jié)果。不同Mtb臨床分離株和不同分枝桿菌的差異可從基因水平進(jìn)行解釋，已發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)胞內(nèi)生長(zhǎng)基因（enhanced intracellular survival，eis）、增強(qiáng)胞內(nèi)生長(zhǎng)速率的基因（in vivo growth，ivg），增強(qiáng)侵入位點(diǎn)（mycobacterial enhanced entry locus，mel2）與 Mtb毒力有關(guān)［4－5］。但基因表達(dá)與否與所處的環(huán)境有關(guān)，單從基因水平無(wú)法解釋菌株在不同培養(yǎng)條件下差異表達(dá)蛋白［6］。

尋找與結(jié)核分枝桿菌INH和S耐藥相關(guān)的新蛋白，以進(jìn)一步解析結(jié)核分枝桿菌INH和S耐藥機(jī)制是以后研究工作的重點(diǎn)內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組學(xué)可全面了解某組織、細(xì)胞器、甚至某生物的整體蛋白，其在疾病診斷標(biāo)識(shí)、疾病機(jī)制研究等方面已發(fā)揮重要作用?；诮?jīng)典雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)存在低分辨率和低敏感度，以及無(wú)法對(duì)不溶性蛋白質(zhì)、高分子量蛋白質(zhì)、極酸性蛋白質(zhì)和極堿性蛋白質(zhì)進(jìn)行分析的缺點(diǎn)。而定量蛋白質(zhì)組學(xué)能全面定量分析差異表達(dá)蛋白，為大范圍鑒定蛋白及其復(fù)合物提供了有效的途徑［7］。核素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是美國(guó)Applied Biosystems公司研發(fā)的一種新的體外多肽標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)定量準(zhǔn)確性高，聯(lián)用液相色譜分離彌補(bǔ)了凝膠分離在蛋白質(zhì)疏水性，相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)方面的限制［10］；該技術(shù)不僅可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣品進(jìn)行定量，從而縮小了不同樣品不同批次間的試驗(yàn)誤差，有較好的重復(fù)性［8］。本研究采用iTRAQ技術(shù)分析耐INH和S的Mtb臨床分離株02166、INH和S敏感株01105和H37Rv的菌體蛋白，通過(guò)Mascot搜索及生物信息學(xué)對(duì)蛋白定量分析，旨在尋找與結(jié)核分枝桿菌INH和（或）S耐藥相關(guān)的新蛋白。

材料和方法

一、菌株

Mtb臨床分離株02166和01105由國(guó)家疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室從臨床分離、鑒定（毒力、耐藥性和基因型）和保存。02166菌株和01105菌株均為北京基因型、毒力高于H37Rv。02166菌株對(duì)INH和S耐藥、對(duì)RFP、EMB、Km、Ofx敏感，01105菌株對(duì)上述抗結(jié)核藥均敏感。02166菌株、01105菌株及H37Rv抽提菌體蛋白的菌體由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。菌體經(jīng)鈷60照射滅活，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

二、主要試劑和儀器

iTRAQ-8plex標(biāo)試劑盒購(gòu)自ABI公司；胰蛋白酶（trypsin）、三乙基碳酸氫銨（triethylammonium bicarbonate，TEAB）購(gòu)自Sigma公司；Bradford定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸｛2-［4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazinyl］ethanesulfonic acid，HEPES｝、3-［3-（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽｛3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonium］-1-propanesulfonate，CHAPS｝、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙腈、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）等試劑均為進(jìn)口分裝試劑，磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）、丙酮、甲酸等為國(guó)產(chǎn)分析純。低溫超高壓連續(xù)細(xì)胞破碎機(jī)JN3000為廣州聚能生物科技有限公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎儀JY92－Ⅱ?yàn)閷幉ㄐ轮ド锟萍脊煞萦邢薰井a(chǎn)品；半制備型高壓液相色譜 （high pressure liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)為日本島津產(chǎn)品，Luna 5uSCX 100A色譜柱（250×4.60mm，5μm）為美國(guó)菲羅門公司（Phenomenex）產(chǎn)品；Nano-LC MicroTOF-QⅡ?yàn)槊绹?guó)Bruker公司產(chǎn)品；C18反相色譜柱（100×0.075mm，5μm）為美國(guó) Agilent產(chǎn)品。

三、菌體蛋白iTRAQ分析

（一）菌體蛋白提取

滅活的 Mtb經(jīng)1×PBS（pH 7.4）洗滌30min，4℃、8000×g離心30min，棄上清。30ml裂解液［Tris-Cl 20mmol／L，pH 8.5；1mmol／L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），1mmol／L PMSF充分懸浮沉淀，低溫超高壓連續(xù)細(xì)胞破碎機(jī)將菌細(xì)胞破碎、功率不超過(guò)1500W，1次循環(huán)后將菌液再重新進(jìn)樣，4次循環(huán)破菌，溶液總體積不超過(guò)50ml。4℃、20000×g離心30min，取20ml上清加入5ml 50%TCA／丙酮（100ml丙酮溶解50g TCA），冰水浴2h，4℃、20000×g離心30min。－20℃預(yù)冷丙酮洗滌沉淀3次，每次洗滌均4℃、20000×g離心30min；沉淀自然晾干，即為制備好的Mtb全菌體蛋白樣品，凍存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

（二）菌體蛋白復(fù)溶及定量

取部分制備好的Mtb全菌體蛋白樣品沉淀于1.5ml離心管，加入復(fù)溶緩沖液（8mol／L尿素，4%CHAPS，30mmol／L HEPES，pH 調(diào)至8.0～8.3），加入PMSF至終濃度1mmol／L、EDTA至終濃度2mmol／L，混勻并冰上放置5min。加入DTT至終濃度10mmol／L，超聲（超聲波發(fā)射2s、間歇3s、功率240W）5min助溶，15℃、20000×g離心25min。取上清，加入DTT至終濃度10mmol／L，56℃恒溫水浴1h，迅速加入IAM至終濃度55～100mmol／L，暗室室溫靜置1h。加入4倍于樣品溶液體積的預(yù)冷丙酮，－20℃沉淀至少3h。4℃、20000×g離心20min，棄上清。300μl 50%TEAB、0.1%SDS溶液復(fù)溶沉淀，超聲（超聲波發(fā)射2s、間歇3s、功率240W）3min助溶。Bradford試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

（三）蛋白質(zhì)酶解

每個(gè)樣品取100μg蛋白，含0.1%SDS的50%TEAB補(bǔ)齊體積至3個(gè)樣品為相同體積。每100μg蛋白質(zhì)樣品加入3.3μg胰蛋白酶，37℃水浴24h；補(bǔ)加1μg胰蛋白酶，37℃水浴12h。酶解樣品真空冷凍干燥，30μl含0.1%SDS的50%TEAB復(fù)溶肽段。取1μl復(fù)溶肽段經(jīng)ZipTip?Pipette Tips脫鹽，1μl基質(zhì)洗脫的蛋白樣品直接上樣基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）檢測(cè)肽質(zhì)量指紋圖譜以評(píng)價(jià)胰蛋白酶消化效果。

（四）標(biāo)記肽段

將iTRAQ-8plex標(biāo)記試劑盒中的標(biāo)記試劑（113、115和121）平衡至室溫，每管標(biāo)記試劑中加入70μl異丙醇，顛倒混勻后加入到對(duì)應(yīng)的酶解肽段樣品中，113標(biāo)記臨床分離株01105、115標(biāo)記臨床分離株02166、121標(biāo)記 H37Rv?；靹?、稍離心后，室溫靜置2h。

（五）半制備型HPLC分離肽段

A 液（25%乙腈，10mmol／L KH2PO4，磷酸調(diào)pH值至3.0孔徑0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾）平衡系統(tǒng)，10～20min；標(biāo)記的樣品用A液稀釋10倍，全部上樣，流速1ml／min。洗脫梯度：0%～5%B液（25%乙腈，2mol／L KCl，10mmol／L KH2PO4，磷酸調(diào)pH值至3.0，孔徑0.22μm 有機(jī)膜過(guò)濾），1min；5%～30%B液，20min；30%～50%B液，5min；50%B液，5min；50%～100%B液，5min；分部收集樣品。收集樣品用C18反相色譜柱除鹽，低溫抽干、0.1%甲酸復(fù)溶肽段用于Nano LC分離。

（六）Nano LC分離及質(zhì)譜鑒定

HPLC分離并脫鹽的0.1%甲酸復(fù)溶肽段上樣。流動(dòng)相 A 液：H2O，0.1%甲酸；B液：乙腈，0.1%甲酸。洗脫梯度為：0%～5%B液，0～10min；5%～45%B液，10～80min；45%～80%B液，80～85min；80%B液，85～100min；80%～5%B液，100～105min；5%B 液，105～120min。流速0.0003ml／min。Nano LC 分離的樣品直接注入MicroTOF-QⅡ質(zhì)譜儀，一級(jí)質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）掃描質(zhì)荷比（m／z）范圍為300～2000。每個(gè)一級(jí)質(zhì)譜圖自動(dòng)選擇3個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行串級(jí)掃描，MS-MS掃描 m／z范圍為200～3000，每組樣品質(zhì)譜鑒定3次重復(fù)。MicroTOF-QⅡ質(zhì)譜儀檢測(cè)參數(shù)：離子源（ESI，正離子掃描），掃描范圍（Auto MS2，m／z 50～2000），Set capillary（1400V），干燥熱源 （150 ℃），碰 撞池 （500.0VPP），傳輸時(shí) 間（150μs），前脈沖存儲(chǔ)時(shí)間（2.0μs），校準(zhǔn)方法（自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)）。

（七）生物信息學(xué)分析

質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜信號(hào)圖。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件DataAnalysis 4.0（美國(guó)Bruker公司）打開(kāi)質(zhì)譜信號(hào)圖，打開(kāi)baf數(shù)據(jù)，自動(dòng)分析標(biāo)峰得到mgf文件。合并mgf文件。將合并后的mgf文件進(jìn)行Mascot檢索（SwissProt下載的Mtb數(shù)據(jù)庫(kù)為搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地搜索）。Mascot檢索參數(shù)：酶（enzyme）：胰蛋 白 酶 （trypsin）；數(shù) 據(jù) 庫(kù) （database）：swissprot-rat；肽段電荷 peptide charge：＋，＋＋，＋＋＋；儀器（instrument）：ESI-QUAD-TOF；固定修飾（fixed modification）：脲甲基化carba-midomethyl（C）；可變修飾（variable modification）：Gln-＞pyro-Glu（N-term Q），氧化反應(yīng) oxidation（M），iTRAQ-8plex（K），iTRAQ-8plex（N-term）和iTRAQ-8plex（Y）；肽質(zhì)量值誤差范圍（peptide tol）：0.1u（monoisotopic）；MS-MS碎片離子的質(zhì)量值誤差范圍（MS-MS tol）：0.1u；最大錯(cuò)配（max missed cleavages）：1。篩選：P＜0.05。差異表達(dá)蛋白質(zhì)定量以Mascot搜庫(kù)結(jié)果為基礎(chǔ)，以mz 113和mz 121為對(duì)照組，依據(jù)Mascot的加權(quán)方式，根據(jù)一組肽段核素報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)含量的比例進(jìn)行定量，02166菌株分別與01105菌株和H37Rv的直接比值顯示相對(duì)定量結(jié)果，根據(jù)不同肽段鑒定次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而判定相對(duì)定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）［9］（DataAnalysis 4.0軟件直接給出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P＜0.05或P＞0.05）。若蛋白質(zhì)標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)信息丟失，則該蛋白無(wú)定量信息。

結(jié) 果

一、菌體蛋白鑒定及相對(duì)定量

02166菌株與01105菌株比較有153個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中，表達(dá)上調(diào)蛋白12個(gè)（3個(gè)蛋白上調(diào)倍數(shù)＞1.2）；表達(dá)下調(diào)蛋白141個(gè)（104個(gè)蛋白下調(diào)倍數(shù)＜0.8）。02166菌株與 H37Rv菌株比較有129個(gè)差異表達(dá)蛋白，表達(dá)上調(diào)蛋白33個(gè)（20個(gè)蛋白上調(diào)倍數(shù)＞1.2）；表達(dá)下調(diào)蛋白96個(gè)（67個(gè)蛋白下調(diào)倍數(shù)＜0.8）。

01105菌株與H37Rv菌株比較差異表達(dá)蛋白有130個(gè)，表達(dá)上調(diào)蛋白113個(gè)（74個(gè)蛋白上調(diào)倍數(shù)＞1.2）；下調(diào)表達(dá)蛋白27個(gè)（11個(gè)蛋白下調(diào)倍數(shù)＜0.8）。

02166菌株與01105菌株和H37Rv比較共同差異表達(dá)蛋白有86個(gè)，共同表達(dá)下調(diào)69個(gè)（其中Rv3118、Rv2626c和Rv2986c表達(dá)下調(diào)倍數(shù)＜0.5），共同表達(dá)上調(diào)6個(gè)（Rv0234c和Rv2466c表達(dá)上調(diào)倍數(shù)＞1.2），11個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)或上調(diào)不一致表1 67個(gè)蛋白在02166菌株與01105菌株比較中差異表達(dá)，卻在02166菌株與H37Rv比較中無(wú)差異表達(dá)；43個(gè)蛋白在02166菌株與H37Rv比較中差異表達(dá)，卻在02166菌株與01105菌株比較中無(wú)差異表達(dá)。

二、差異表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分布

02166菌株與01105菌株或H37Rv比較無(wú)冗余的差異表達(dá)蛋白共196個(gè)，其理論相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分布廣泛，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為7.63～326.22；等電點(diǎn)范圍為3.74～12.48。83.4%差異表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于60，77.4%差異表達(dá)蛋白等電點(diǎn)小于7（圖1A，B）。

三、差異表達(dá)蛋白功能分析

根據(jù)巴斯德研究所功能分類樹(shù)（http：／／genolist.pasteur.fr／tuberculist）對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分類，差異表達(dá)蛋白主要參與脂類代謝（1）、中間代謝和呼吸（7）和保守假定蛋白（10）；兩組差異表達(dá)蛋白均無(wú)屬于穩(wěn)定RNAs（4）、插入序列和噬菌體（5）、PE／PPE 家 族 蛋 白 （6）、未 知 功 能 蛋 白 （8）（圖2）。

四、核糖體蛋白和參與脂類代謝蛋白

9個(gè)核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)，其中Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701和Rv0719為50S核糖體蛋白，Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c為30S核糖體蛋白，Rv1630為可能的核糖體蛋白S1。Rv0641（50S核糖體蛋白）和Rv0707（30S核糖體蛋白）僅在02166菌株與01105菌株比較中下調(diào)表達(dá)，Rv2442c和Rv3456c（50S核糖體蛋白）僅在02166菌株與H37Rv比較中分別下調(diào)和上調(diào)表達(dá)。

表1 02166菌株與01105菌株和H37Rv比較表達(dá)上調(diào)或下調(diào)不一致的蛋白

34個(gè)脂類代謝（1）蛋白在INH耐藥菌株中差異表達(dá)：Rv3804c、Rv3140、Rv2245、Rv0824c、Rv1925、Rv3130c、Rv3801c、Rv1094、Rv2941和 Rv3800c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)；Rv0154c、Rv0222、Rv0242c、Rv0503c、Rv1070c、Rv1492、Rv2187、Rv2247、Rv2831 和 Rv3274c在02166菌株與01105菌株比較中下調(diào)表達(dá)，Rv0873和Rv1181在02166菌株與01105菌株比較中上調(diào)表達(dá)；Rv0231、Rv1074c、Rv1483、Rv2244、Rv2246、Rv2524c、Rv2940c、Rv3720和 Rv3774在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達(dá)，而Rv1543、Rv1544和Rv3061c在02166菌株與H37Rv比較中上調(diào)表達(dá)。

討 論

研究表明iTRAQ技術(shù)可用于鑒定大分子、極酸、極堿蛋白，不僅可以彌補(bǔ)雙向電泳不足，而且iTRAQ定量鑒定的蛋白數(shù)量多于經(jīng)典雙向凝膠電泳［10］。本研究采用iTRAQ技術(shù)有效地定量鑒定了耐INH和S Mtb臨床分離株02166、藥物敏感臨床分離株01105和標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv之間的差異蛋白，02166菌株菌體蛋白與01105菌株和H37Rv比較共同差異表達(dá)蛋白有86個(gè)，且差異表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分布范圍廣泛。

katG （Rv1908c）、aphC （Rv2428）、kasA（Rv2245）和inhA（Rv1484）基因突變與部分耐INH的 Mtb臨床分離株相關(guān)［11－12］。Rv2245和 Rv1484參與脂肪酸合成，Rv1908c和Rv2428參與解毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Rv1908c和Rv2245在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)，Rv2428只在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達(dá)，Rv1484在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均未出現(xiàn)差異表達(dá)。藥物S主要與細(xì)菌核糖體30S亞基單位結(jié)合，抑制蛋白合成。研究表明，rpsL和rrs基因突變與S耐藥相關(guān)［13］，rpsL編碼30S核糖體蛋白S12（Rv0682）。本研究未鑒定到Rv0682，但發(fā)現(xiàn)9個(gè)核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)，其中Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701和Rv0719為50S核糖體蛋白，Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c為30S核糖體蛋白，Rv1630為可能的核糖體蛋白S1。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) Rv0056、Rv0652、Rv0701、Rv1630和Rv2785c在Mtb中均為藥物／化合物優(yōu)先作用靶點(diǎn)（http：／／tdrtargets.org／）。但這5個(gè)核糖體蛋白在02166菌株中下調(diào)表達(dá)與Mtb S耐藥的關(guān)系，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鑒定到5個(gè)蛋白（Rv1446c、Rv3028c、Rv0491、Rv2971和Rv2145c）在INH耐藥Mtb中上調(diào)表達(dá)［14］。S耐藥株上調(diào)表達(dá)Rv0350、Rv0440、Rv1240、Rv3075c、Rv2971、Rv3028c、Rv2145c、Rv2031c和 Rv0569，進(jìn)一步采用silico docking分析表明只有Rv0350、Rv0440和Rv2971與S呈現(xiàn)有意義的相互作用［15］。因此，Rv2971、Rv3028c和Rv2145c在S耐藥株和INH耐藥株中均上調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)Rv0440、Rv2145c和Rv3028c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)，Rv0350和Rv2971、Rv1240分別在02166菌株與01105菌株比較中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)、Rv3075和Rv2031在02166菌株與H37Rv比較中下調(diào)表達(dá)，Rv0491、Rv0569和Rv1446c在本研究中未鑒定到。這種不同蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)不同差異表達(dá)蛋白的現(xiàn)象較常見(jiàn)［16］。

綜上所述，定量蛋白質(zhì)組學(xué)能有效鑒定到差異表達(dá)蛋白。Rv0234c、Rv2466c、Rv3118、Rv2626c和Rv2986c在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均差異表達(dá)（下調(diào)倍數(shù)＜0.5或上調(diào)倍數(shù)＞1.2），9個(gè)核糖體蛋白在02166菌株與01105菌株和H37Rv比較中均下調(diào)表達(dá)。這些蛋白與INH和S耐藥關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，因此，值得進(jìn)一步探討這些蛋白與Mtb INH、S耐藥的關(guān)系，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌INH、S耐藥機(jī)制提供新靶點(diǎn)。

［1］Espasa M，González-Martín J，Alcaide F，et al.Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes.J Antimicrob Chemother，2005，55（6）：860-865.

［2］Ulger M，Aslan G，Emekda?G，et al.Investigation of rpsL and rrs gene region mutations in streptomycin resistant Mycobacterium tuberculosis complex isolates.Mikrobiyol Bul，2009，43（1）：115-120.

［3］Nhu NT，Lan NT，Phuong NT，et al.Association of streptomycin resistance mutations with level of drug resistance and Mycobacterium tuberculosis genotypes.Int J Tuberc Lung Dis，2012，16（4）：527-531.

［4］Zhang M，Gong J，Lin Y，et al.Growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages.Infect Immun，1998，66（2）：794-799.

［5］Janagama HK，Hassounah HA，Cirillo SL，et al.Random inducible controlled expression（RICE）for identification of mycobacterial virulence genes.Tuberculosis（Edinb），2011，91 Suppl 1：S66-68.

［6］Florczyk MA，McCue LA，Stack RF，et al.Identification and characterization of mycobacterial proteins differentially expressed under standing and shaking culture conditions，including Rv2623from a novel class of putative ATP-binding proteins.Infect Immun，2001，69（9）：5777-5785.

［7］Kumar SG，Venugopal AK，Mahadevan A，et al.Quantitative proteomics for identifying biomarkers for tuberculous meningitis.Clin Proteomics，2012，9（1）：12.

［8］Wu WW，Wang G，Baek SJ，et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods，DIGE，cICAT，and iTRAQ，using 2Dgel-or LC-MALDI TOF／TOF.J Proteome Res，2006，5（3）：651-658.

［9］Ong SE，Mann M.Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative.Nat Chem Biol，2005，1（5）：252-262.

［10］Shui W，Gilmore SA，Sheu L，et al.Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions：the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.J Proteome Res，2009，8（1）：282-289.

［11］Soudani A，Hadjfredj S，Zribi M，et al.Genotypic and phenotypic characteristics of tunisian isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.J Microbiol，2011，49（3）：413-417.

［12］Yao C，Zhu T，Li Y，et al.Detection of rpoB，katGand inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.Clin Microbiol Infect，2010，16（11）：1639-1643.

［13］TudóG，Rey E，Borrell S，et al.Characterization of mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the area of Barcelona.J Antimicrob Chemother，2010，65（11）：2341-2346.

［14］Jiang X，Zhang W，Gao F，et al.Comparison of the proteome of isoniazid-resistant and-susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis.Microb Drug Resist，2006，12（4）：231-238.

［15］Sharma P，Kumar B，Gupta Y，et al.Proteomic analysis of streptomycin resistant and sensitive clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.Proteome Sci，2010，8：59.

［16］Mehaffy C，Hess A，Prenni JE，et al.Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.Proteomics，2010，10（10）：1966-1984.