徐堅 胡志雄 杜紅梅 孫書明 徐林根 余竹元

（1．復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508；2．復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海 200032）

肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，Cpn）是一類能通過細(xì)菌濾器、有獨特發(fā)育周期的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，是衣原體屬中的新種。約10%的人類急慢性呼吸系統(tǒng)感染性疾?。ㄈ缟鐓^(qū)獲得性肺炎、支氣管炎、咽炎和鼻竇炎）由Cpn引起；Cpn還與中耳炎、虹膜炎、心肌炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性紅斑等疾病有關(guān)；Cpn也是艾滋病、白血病患者繼發(fā)感染的重要病原菌之一。Karimi等［1］報告，健康獻(xiàn)血者血中也可檢出Cpn－DNA和抗原，普通人群中Cpn的感染率更高。Lin等［2］報告，在中國臺灣成年人中，血清Cpn－IgG陽性率達(dá)45．5%。國內(nèi)外診斷Cpn感染的方法有病原體直接檢出法、核酸檢測法和血清學(xué)方法。最常用的血清學(xué)方法是微量免疫熒光（micro－immunofluorescence，MIF）法，被公認(rèn)為是血清學(xué)診斷Cpn感染的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。國內(nèi)所用的Cpn抗原（Cpn－Ag）至今仍依賴于進口。近年來，我們自制Cpn－Ag并將其用于臨床檢測，發(fā)現(xiàn)與進口Cpn－Ag具有相似的效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2005年11月—2011年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院就診的268例患者，其中冠心病、高血壓、心肌梗死等心血管疾病患者61例；肺炎、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病患者132例；慢性鼻炎、鼻竇炎、咽喉炎、扁桃體炎等耳鼻咽喉疾病患者75例。

1．2 實驗方法

1．2．1 Cpn的分離、培養(yǎng)和傳代

1．2．1．1 人外周血單核細(xì)胞（PBMC）的分離和PBMC中Cpn－Ag的檢測：依據(jù)參考文獻(xiàn)［4］?？乖栃耘袛鄻?biāo)準(zhǔn) ：≥100個亮點為強陽性，10～100個亮點為陽性，5～10個亮點為弱陽性，≤4個亮點為陰性。

1．2．1．2 Cpn的分離、培養(yǎng)和2次傳代：配制無血清的1640培養(yǎng)液、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）液，并用NaHCO3調(diào)pH值至8．0，備用。將Cpn陽性的PBMC制成0．2mL PBMC懸液，邊振蕩邊在90s內(nèi)滴入0．2mL 30%的PEG，使Cpn從PBMC中釋放出來，然后移入鋪滿Hep－2細(xì)胞的含有1．8mL 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，混勻后離心1 h，然后加入11mL Cpn生長介質(zhì)［含4%胎牛血清、慶大霉素（25μg／mL）、萬古霉素（25μg／mL）、兩性霉素B（2．5μg／mL）、放線菌酮（0．5μg／mL）和葡萄糖（4．5mg／mL）］，置于 CO2培養(yǎng)箱中37．4℃培養(yǎng)。第3天離心并更換Cpn生長介質(zhì)；第4天、第5天再分別離心1次；培養(yǎng)7d。將Cpn－Ag陽性的第1次傳代的Hep－2細(xì)胞凍融破碎2次后，分成2份倒入另2瓶鋪滿Hep－2細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，離心1h后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的第3、4、5天分別離心1h，繼續(xù)培養(yǎng)；2d后取部分Hep－2細(xì)胞檢測Cpn－Ag。采用PCR法檢測2代Hep－2細(xì)胞中Cpn－DNA。

1．2．2 自制Cpn－Ag與進口Cpn單克隆抗體（Cpn－McAb）結(jié)合反應(yīng)的評估

1．2．2．1 Cpn－Ag的制備：將2次傳代 Cpn－Ag陽性的Hep－2細(xì)胞（106／mL）凍融破碎，制成混懸液，作為本實驗自制的Cpn－Ag。

1．2．2．2 自制Cpn－Ag與Cpn－McAb的結(jié)合反應(yīng)：采用Dot－ELISA法，硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)棕褐色斑點為陽性，不顯色為陰性。

1．2．3 應(yīng)用自制 Cpn－Ag與進口 Cpn－Ag（AR39－Ag）同時檢測臨床血漿樣本：采用MIF法檢測血漿抗Cpn特異性抗體（IgA、IgG和IgM）。Cpn感染的MIF診斷標(biāo)準(zhǔn)如下，IgA、IgM抗體陽性：滴度≥1∶16；IgG抗體陽性：滴度≥1∶64［5］。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。對同一樣本的每一檢品分別用自制及進口Cpn－Ag進行檢測，計數(shù)檢測結(jié)果同時為陽性、同時為陰性及分別陽性的標(biāo)本個數(shù)；然后進行一致性檢測，Kappa值＞0．75為具有高度一致性。對兩抗原檢測陽性結(jié)果的抗體滴度水平進行統(tǒng)計，取其幾何均數(shù)，并進行t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 分離、培養(yǎng)Cpn后MIF的檢測結(jié)果 Cpn－Ag陰性的Hep－2細(xì)胞，特征性蘋果綠亮點≤4個亮點／視野；Cpn－Ag陽性的 Hep－2破碎細(xì)胞（2次傳代培養(yǎng)7d后的Hep－2破碎細(xì)胞）可見特征性蘋果綠亮點≥100個／視野。

2．2 2次傳代的Cpn的PCR檢測結(jié)果 擴增產(chǎn)物在1．2%瓊脂糖凝膠中電泳，可見含有Cpn－DNA特異序列的437bp的片段。

2．3 Dot－ELISA 法 觀 察 自 制 的 Cpn－Ag 與 進 口Cpn－McAb的結(jié)合反應(yīng) 結(jié)果顯示，自制的Cpn－Ag能夠與進口Cpn－McAb發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。

2．4 檢測血漿中Cpn抗體滴度 自制的Cpn－Ag與進口Cpn－Ag的檢測一致率均達(dá)90%以上；以進口Cpn－Ag檢測為標(biāo)準(zhǔn)，自制Cpn－Ag檢測靈敏度、特異度均在90%以上；陽性似然比＞10，其中IgM陽性似然比高達(dá)30；陰性似然比＜0．1，見表1～3。配對卡方檢驗顯示，自制與進口Cpn－Ag檢測血漿IgA、IgG、IgM結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；一致性檢驗Kappa值＞0．75，兩者具有高度一致性，見表4～6。

表1 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測血漿Cpn－IgA的一致性分析

表2 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測血漿Cpn－IgG的一致性分析

表3 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測血漿Cpn－IgM的一致性分析

表4 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測268例血漿Cpn－IgA結(jié)果分析

表5 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測268例血漿Cpn－IgG結(jié)果分析

表6 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測268例血漿Cpn－IgM結(jié)果分析

2．5 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測陽性結(jié)果的抗體滴度的分析 取幾何均數(shù)，顯示自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測3種抗體滴度的均數(shù)差異均＜1個稀釋度，兩種抗原檢測陽性結(jié)果的抗體滴度總體水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表7。

表7 自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測陽性結(jié)果抗體滴度幾何均數(shù)比較

3 討 論

Cpn與多種疾病的發(fā)病相關(guān)，由于Cpn感染缺乏特異性，因此其診斷主要依靠實驗室檢查［6］。目前，MIF法被認(rèn)為是血清學(xué)診斷急慢性Cpn感染的金標(biāo)準(zhǔn)。

我們自制了Cpn－Ag，并評估其對血漿樣本的檢測效果。Dot－ELISA結(jié)果表明，自制的Cpn－Ag可與進口的Cpn－McAb發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。隨后我們采用自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag，通過 MIF法檢測了患者的血漿樣本。表1～3結(jié)果顯示，自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測同時陽性者IgA（＋）141例，符合率92．5%；IgG（＋）153例，符合率92．2%；IgM（＋）91例，符合率95．1%。進行配對卡方檢驗，按α＝0．05水準(zhǔn)，自制Cpn－Ag與進口Cpn－Ag檢測血漿中3種Cpn抗體的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。進一步進行一致性檢測，Kappa值均＞0．75，表明兩種抗原的檢測結(jié)果具有高度的一致性。以進口Cpn－Ag檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，自制的Cpn－Ag檢測血漿樣本中的Cpn－IgA的靈敏度和特異度分別為94．0%、90．7%，IgG 分別為92．7%、91．3%，IgM 分別為91．9%、97．0%。故本研究中自制Cpn－Ag可用于Cpn感染的的診斷。同時，為全面評估此診斷試驗的診斷價值，我們計算了似然比，IgA和IgG陽性似然比約為10，即陽性結(jié)果中來自Cpn感染的可能性為非Cpn感染的10倍；陽性似然比在IgM高達(dá)30；而針對3種抗體的陰性似然比均＜0．1，即陰性結(jié)果中來自Cpn感染的可能性為非Cpn感染的1／10以下。以上結(jié)果均表明，自制Cpn－Ag對血漿樣本中Cpn的診斷效果較理想。對于兩種抗原檢測的陽性結(jié)果，對其抗體滴度水平進行統(tǒng)計，取其幾何均數(shù)，顯示兩種抗原檢測3種抗體滴度的幾何均數(shù)相近，差異均＜1個稀釋度；進行兩獨立樣本t檢驗，兩種抗原檢測陽性結(jié)果的抗體滴度總體水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表7。

綜上所述，本研究中自制的Cpn－Ag用于檢測患者血漿中Cpn－IgA、IgG、IgM，有較高的靈敏度和特異度，與進口Cpn－Ag檢測具有高度一致性。自制Cpn－Ag的方法簡便、價格低廉，通過5年多來的臨床標(biāo)本檢測應(yīng)用，其結(jié)果可靠。

［1］ Karimi G，Samiei Sh，Hatami H，et al．Detection of Chlamydia pneumoniae in peripheral blood mononuclear cells of healthy blood donors in Tehran Regional Educational Blood Transfusion Centre［J］．Transfus Med，2010，20（4）：237－243．

［2］ Lin CY，Su SB，Chang CC，et al．The association between Chlamydia pneumoniae and metabolic syndrome in Taiwanese adults［J］．South Med J，2009，102（12）：1203－1208．

［3］ Bennedsen M，Berthelsen L，Lind I，et al．Performance of three microimmunofluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae immunoglobulin M，G，and A antibodies［J］．Clin Diagn Lab Immunol，2002，9（4）：833－839．

［4］ 王衛(wèi)群，張瑞華，龔輝，等．外周血單核細(xì)胞中肺炎衣原體特異性抗原的檢測［J］．中國臨床醫(yī)學(xué)，2002，9（3）：243－245．

［5］ Brandén E，Koyi H，Gnarpe J，et al．Chronic Chlamydia pneumoniae infection is a risk factor for the development of COPD［J］．Respir Med，2005，99（1）：20－26．

［6］ 羅海波，張福森，何哲生，等．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)細(xì)菌學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：214－216．