石寶俊，高君澤，黃曉德，趙伯濤*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京 210042;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇南京 210046)

胡椒為胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的果實(shí)。當(dāng)果穗基部的果實(shí)開始變紅時(shí)，剪下果穗，曬干或烘干后，即成黑褐色，取下果實(shí)，通稱黑胡椒。如全部果實(shí)均已變紅時(shí)采收，用水浸漬數(shù)天，擦去外果皮，曬干，則表面里灰白色，通稱白胡椒。

胡椒堿(C17H19NO3)為白胡椒的活性成分，具有抗腫瘤［1］、抗氧化［2］、抗消化系統(tǒng)潰瘍［3］、抗抑郁［4］、抗免疫調(diào)節(jié)等作用［5］。劉文等［6］同時(shí)用酸水和75%乙醇進(jìn)行提取胡椒堿，比較后發(fā)現(xiàn)pH值為3.5的酸水提取只比乙醇提取略低，認(rèn)為乙醇的提取、回收成本較高，酸水提取更好。侯文潔等［7］則選擇用甲醇提取胡椒堿，他們認(rèn)為乙醇價(jià)格高，大規(guī)模生產(chǎn)成本較高，用水做提取價(jià)格便宜，但提取得到的水溶性成份多，后處理成本較高。選擇甲醇為提取劑，所獲得的提取率高，而且后期處理工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。但是其有毒，工業(yè)生產(chǎn)不安全。用乙醇提取白胡椒時(shí)，隨乙醇中含水量的增加，提取率增加，同時(shí)后續(xù)的操作如過濾和濃縮的難度也增加。故在提盡胡椒堿的前提下，采用無水乙醇和95% 乙醇使提取過程簡(jiǎn)化，提取效果較好;而比較二者，95%乙醇更適合［8］。另外，95%乙醇提取的黑胡椒油樹脂得率最低［9］，后處理簡(jiǎn)單。本實(shí)驗(yàn)采用95%乙醇提取胡椒堿，用95%乙醇提取，蒸餾回收后的乙醇還是95%，可以循環(huán)使用。

1 材料

1.1 儀器

Agilent高效液相儀，紫外檢測(cè)器;Agilent ZORBAX－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，SF－400 電子天平(好又多電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)，DW調(diào)溫電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)學(xué)器械廠)。

1.2 藥物與試劑

白胡椒(海南省國(guó)營(yíng)東昌農(nóng)場(chǎng))，乙醇(體積分?jǐn)?shù)95%，食品級(jí))，甲醇(色譜純)，重蒸水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相:甲醇－水(70∶30);檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm［10］;25℃;進(jìn)樣量 20 μL，流速 l mL/min。胡椒堿在此條件下保留時(shí)間約為5.8 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取胡椒堿對(duì)照品25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解至刻度，精密移取此溶液3，4，5，6，7，8 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，定容。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程:y=149.30x－388.96，R2=0.9989，結(jié)果表明胡椒堿濃度在 60.48～161.28 μg/mL范圍內(nèi)，胡椒堿峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

圖1 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 胡椒堿的純度測(cè)定

取各條件制得的胡椒堿結(jié)晶2.5 mg置25 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容成100 μg/mL的溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件精密吸取20 μL溶液進(jìn)樣，所得峰面積帶入對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算得出其實(shí)際濃度，然后計(jì)算其純度。

2.4 乙醇量及提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

設(shè)計(jì)乙醇的用量為三個(gè)水平:10∶1，8∶1;8∶1，6∶1;6∶1，4∶1?；亓鲿r(shí)間也為三個(gè)水平即 1.5 h，1 h，0.5 h.

分別取100 g已粉碎白胡椒，置于燒瓶中，按下圖實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需加入95%乙醇并加熱回流提取規(guī)定時(shí)間，所得結(jié)果如下:

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照

從圖中可以看出，95%乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比分別為 8∶1，6∶1時(shí)，提取 1 h 和 1.5 h 明顯優(yōu)于0.5 h，提取1.5 h 和1 h 相差僅 4.3%，為了節(jié)約成本，故提取1 h更為合適;當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 10∶1，8∶1和 8∶1，6∶1的明顯優(yōu)于6∶1，4∶1，但用10∶1，8∶1的量?jī)H比用8∶1，6∶1時(shí)多出 3.4%，乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 8∶1，6∶1時(shí)更好。所以以乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1，分別提取1 h最好，既能盡可能多得提取出胡椒堿，又節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.5 重結(jié)晶時(shí)溫度的影響

表2 40℃，60℃，80℃下重結(jié)晶對(duì)胡椒堿結(jié)晶量的影響

取100 g胡椒，粉碎，分別加入1000 mL，800 mL乙醇提取兩次，每次1 h，制得的胡椒堿粗品在40℃，60℃，80℃下溶解，重結(jié)晶2次。從表2中可以看出，40℃下所得結(jié)晶很少，80℃時(shí)最多。但是考慮到80℃已經(jīng)超過乙醇的沸點(diǎn)，在此溫度下溶解胡椒堿粗品時(shí)，乙醇會(huì)很快蒸發(fā)，無法準(zhǔn)確把握需要乙醇量;且結(jié)晶時(shí)發(fā)現(xiàn)，母液干涸，成果凍狀，不好分離出結(jié)晶，所得結(jié)晶純度較低。所以應(yīng)改考慮60℃和70℃情況下胡椒堿的結(jié)晶情況。

表3是胡椒堿在60℃，70℃下重結(jié)晶的比較。其中編號(hào)1～5提取胡椒堿時(shí)所用95%乙醇與胡椒堿的體積質(zhì)量比為10∶1，8∶1;除編號(hào)4以外均為重結(jié)晶2次。經(jīng)過HPLC測(cè)定編號(hào)4的樣品后發(fā)現(xiàn)，在60℃下重結(jié)晶一次純度便可達(dá)到90%以上。故在編號(hào)6～11的樣品均只結(jié)晶了1次，測(cè)定后發(fā)現(xiàn)純度均能超過90%。

由于在中期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取液中的胡椒堿用10∶1，8∶1的量乙醇僅比用 8∶1，6∶1的量時(shí)多出3.4%，用乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為 8∶1，6∶1更好，所以編號(hào)6～11的樣品選用體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1的比例。

表3 60℃和70℃下胡椒堿重結(jié)晶的比較

從表3中比較60℃和70℃重結(jié)晶后胡椒堿得率后可以發(fā)現(xiàn)，60℃和70℃相差不大。而60℃下的結(jié)晶純度比70℃下的稍高。70℃下胡椒堿的溶解率較高，相對(duì)60℃下結(jié)晶時(shí)加入的乙醇量難控制些，結(jié)晶顏色也比60℃下的深。故最終選定60℃為最佳重結(jié)晶溫度。

3 結(jié)論

本論文以白胡椒為實(shí)驗(yàn)材料，使用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行提取胡椒堿，對(duì)乙醇法提取胡椒堿的工藝進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)提取物的純度和提取率進(jìn)行測(cè)定，以尋找最佳工藝流程的方法。通過實(shí)驗(yàn)可以得出:用95%的乙醇提取胡椒堿，便于回收再利用，乙醇回收達(dá)80%以上。用乙醇與胡椒的體積質(zhì)量比為8∶1，6∶1回流提取1 h后，在60℃下重結(jié)晶胡椒堿粗品，所能得到的純度90%以上。本實(shí)驗(yàn)所選用的工藝，產(chǎn)品經(jīng)精制后得到純度高，工藝簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)有借鑒意義。

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