孫 鵬，趙旭博，孫先鋒，馬永征

(1.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.北京市食品研究所，北京 100162)

雙歧桿菌是廣泛存在于人體和動(dòng)物腸道內(nèi)的有益菌，具有促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)免疫力，抗癌及抗腫瘤，降低血脂、保護(hù)及改善肝功能、調(diào)理腸道內(nèi)環(huán)境、抗衰老、通便等功能[1-3]，但要實(shí)現(xiàn)上述功能，產(chǎn)品中的雙歧桿菌在保質(zhì)期內(nèi)必須保持在106CFU/mL(106CFU/g)以上[4]，因此提高雙歧桿菌的活菌數(shù)是產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵，培養(yǎng)基優(yōu)化是提高活菌數(shù)的常用手段之一。

目前雙歧桿菌活菌數(shù)的提高主要通過在培養(yǎng)基中添加果蔬汁如胡蘿卜汁、番茄汁、平菇汁、卷心菜汁等[5-9]，益生元如低聚果糖、菊糖及魔芋葡萄甘露低聚糖等[10-12]，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、乳鐵蛋白及乳清蛋白等[13-16]等來實(shí)現(xiàn)，或以天然提取物如菊芋汁、麥芽汁等[17-19]為培養(yǎng)基主要成分通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提高雙歧桿菌活菌數(shù)。如韓雪等[5]從海帶汁、平菇汁及胡蘿卜汁等果蔬汁中篩選了兩株雙歧桿菌的增殖因子，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行了雙歧桿菌培養(yǎng)基的優(yōu)化；劉子宇等[6]以TPYG培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了Bifidobacterium breve A04培養(yǎng)基；杜鵬等[7]采用采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了嬰兒雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基；胡德亮等[18]研究了菊芋對(duì)雙歧桿菌促生長(zhǎng)的影響；孫記錄等[19]篩選優(yōu)化了菊芋汁雙歧桿菌培養(yǎng)基；Oliveira等[10]研究發(fā)現(xiàn)添加菊糖能縮短嗜熱乳鏈球菌和乳雙歧桿菌酸乳發(fā)酵時(shí)間，并提高了活菌數(shù)；Prasanna等[13]研究了乳清蛋白水解物等幾種氮源對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)多糖的影響，發(fā)現(xiàn)在脫脂乳中添加1.5%酪蛋白水解物能促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)；Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白能促進(jìn)短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的生長(zhǎng)；Janer等[16]研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide，CMP)和乳清蛋白濃縮物(whey protein concentrate，WPC)能促進(jìn)乳雙歧桿菌的生長(zhǎng)，乳中添加20g/L CMP在37℃條件下培養(yǎng)24h能使活菌數(shù)提高1.5(lg(CFU/g))，添加20g/L WPC可使乳雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到9.1(lg(CFU/g))。

但添加果蔬汁會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基配制步驟增加，操作繁瑣，不適宜用于工業(yè)化。文獻(xiàn)中添加益生元一般僅選擇添加某一種低聚糖或菊糖，沒有考慮各種低聚糖或菊糖對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響。此外，沒考慮在培養(yǎng)基中添加氨基酸對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響。本研究以長(zhǎng)雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過碳源、益生元及氨基酸單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出主因子，再通過爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高活菌數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)雙歧桿菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) 西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院菌種室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

活化培養(yǎng)基：MRS肉湯，并添加0.5g/L濾膜過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS瓊脂；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：無碳源MRS肉湯。

葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖 西安羅森伯生物科技有限公司；氨基酸 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F無菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；756PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；BS224S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海精科儀器有限公司；厭氧裝置(厭氧培養(yǎng)罐、產(chǎn)氣袋及氧氣指示劑) 日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將半胱氨酸鹽酸鹽配成濃溶液，然后采用0.22μm的濾膜過濾除菌，再將其添加到滅菌冷卻后的MRS肉湯中，使其終質(zhì)量濃度為0.5g/L，將其用來活化凍干的長(zhǎng)雙歧桿菌菌粉，37℃厭氧培養(yǎng)24h，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種，活化3次后備用。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)首先通過單因素試驗(yàn)分別考察4種碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖)、6種益生元(低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、水蘇糖和菊糖)、8種氨基酸(亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和絲氨酸)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響，獲得能促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，再采用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)篩選主因子，接著進(jìn)行爬坡試驗(yàn)確定最大活菌數(shù)區(qū)域，最后通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基組成，Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理均利用Design Expert 8.06軟件完成。

1.3.3 OD值及pH值測(cè)定

采用紫外-可見分光光度計(jì)法測(cè)定培養(yǎng)液在600nm波長(zhǎng)處的濁度(OD600nm值)，未接入菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照。通過PHS-3C酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。

1.3.4 活菌數(shù)測(cè)定

培養(yǎng)液采用10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度傾注平板，使其均勻分布于培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線

將已活化好的長(zhǎng)雙歧桿菌按照體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入含0.5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯中，充分混勻后37℃培養(yǎng)24h，每隔2h取樣測(cè)定其在600nm波長(zhǎng)處的OD600nm值、培養(yǎng)液pH值及活菌數(shù)，以這3個(gè)指標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

圖 1 長(zhǎng)雙歧桿菌在MRS肉湯中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bifi dobacterium longum in MRS broth

由圖1可知，0～4h為長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的延滯期，然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至18h進(jìn)入穩(wěn)定期，然后進(jìn)入衰亡期，最佳培養(yǎng)時(shí)間為18h，此時(shí)活菌數(shù)為8.96×108CFU/mL，OD600nm值為1.154，pH值為5.15。在培養(yǎng)18h后，活菌數(shù)逐漸下降，而OD600nm繼續(xù)增加，pH值緩慢降低，但18h后的OD600nm值不能反映培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，18h之前的OD600nm值曲線和活菌數(shù)曲線趨勢(shì)一致，因此在穩(wěn)定期前的OD600nm值能反映長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)情況。在后續(xù)的單因素試驗(yàn)中測(cè)定18h的OD600nm值來判斷各物質(zhì)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響。

2.2 碳源、益生元及氨基酸對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

2.2.1 碳源對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

在無碳源的MRS肉湯中分別加入葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖，并將質(zhì)量濃度分別調(diào)整為10、15、20、25、30g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長(zhǎng)雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測(cè)定OD600nm值，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 碳源對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of carbon source on the growth of B. longum

由圖2可知，隨著碳源添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均先增大后減小，在葡萄糖、乳糖及麥芽糖質(zhì)量濃度為20g/L及蔗糖質(zhì)量濃度為15g/L時(shí)，培養(yǎng)液的OD600nm值達(dá)到最大值，分別為1.146、1.190、1.024、0.987，說明長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)這4種糖的利用率大小順序?yàn)槿樘牵酒咸烟牵钧溠刻牵菊崽?，其中碳源為蔗糖及麥芽糖時(shí)不利于長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，其OD600nm值與葡萄糖和乳糖作為碳源的結(jié)果存在顯著性差異(P＜0.05)，同時(shí)，葡萄糖和乳糖的最大OD600nm值間也存在顯著性差異(P＜0.01)，因此乳糖為該菌的最佳碳源，在后續(xù)研究中以乳糖為該菌的碳源。

2.2.2 益生元對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

圖 3 益生元對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of prebiotics on the growth of B. longum

在以20g/L乳糖為碳源的MRS肉湯中分別加入低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖及菊糖6種益生元，并將質(zhì)量濃度分別調(diào)整為2、4、6、8、10g/L，118℃滅菌20min，冷卻后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，再按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長(zhǎng)雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測(cè)定OD600nm值及pH值，結(jié)果如圖3所示。隨著益生元添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均出現(xiàn)了先增加后降低的情況，但均高于對(duì)照，說明益生元的添加能促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。培養(yǎng)液OD600nm值最大時(shí)的益生元添加量分別為低聚果糖4g/L、低聚木糖2g/L、低聚異麥芽糖6g/L、低聚半乳糖8g/L、水蘇糖2g/L及菊糖4g/L，對(duì)應(yīng)的OD600nm值分別為1.149、1.275、1.081、1.184、1.093及1.269，其中低聚異麥芽糖和水蘇糖添加量對(duì)該菌的生長(zhǎng)沒有顯著的促進(jìn)作用(P＞0.05)，其他4種益生元均能顯著性促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)(P＜0.05)，其中以低聚木糖最佳、其次為菊糖和低聚異麥芽糖，最后為低聚果糖。

2.2.3 氨基酸對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

將以20g/L乳糖為碳源的MRS滅菌冷卻后，分別加入過濾除菌的亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及絲氨酸8種氨基酸的濃溶液，并將其質(zhì)量濃度均調(diào)整為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，然后加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽，最后按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入長(zhǎng)雙歧桿菌，37℃條件下恒溫培養(yǎng)18h后測(cè)定OD600nm值及pH值，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 氨基酸對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of amino acid on the growth of B. longum

由圖4可知，隨著氨基酸添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600nm值均出現(xiàn)了先增加后降低的情況。培養(yǎng)液OD600nm值最大時(shí)的氨基酸添加量為：亮氨酸0.2g/L、谷氨酸0.3g/L、精氨酸0.2g/L、賴氨酸0.2g/L、蛋氨酸0.3g/L、脯氨酸0.1g/L、苯丙氨酸0.4g/L及絲氨酸0.3g/L，對(duì)應(yīng)的最大值分別為1.062、1.121、1.058、1.111、1.132、1.130、1.148及1.063，其中亮氨酸、精氨酸及絲氨酸對(duì)該菌的生長(zhǎng)沒有顯著的促進(jìn)作用(P＞0.05)，其他5種氨基酸均能顯著性促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)(P＜0.05)，其中以苯丙氨酸最佳、其次為蛋氨酸和脯氨酸，最后為谷氨酸和賴氨酸。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因子

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸9個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高(+1)低(－1)兩個(gè)水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為單位體積中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值(Y)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，其中X6和X11為虛擬項(xiàng)；因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental results of Plackett-Burman design

表 2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及方差分析Table 2 The levels of Plackett-Burman tests and analvsis of variance

由表2可知，在培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌的過程中，在α=0.10的顯著水平上，低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值影響顯著，其中低聚木糖和菊糖添加量對(duì)培養(yǎng)液中雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的影響為負(fù)效應(yīng)，脯氨酸為正效應(yīng)，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表 3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the steepest ascent experiment

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以應(yīng)先逼近最大影響區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)低聚木糖、菊糖和脯氨酸添加量進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。各因素的取值在第3組(0+2Δ)附近時(shí)培養(yǎng)液中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值最高，故采用低聚木糖1.6g/L、菊糖3.4g/L和脯氨酸0.4g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定顯著影響因素的最佳值

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平選擇如表4所示，其結(jié)果如表5所示。

表 4 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及其編碼Table 4 Fractors, levels and codes of Box-Behnken design

表 5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken tests

根據(jù)表5中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用Design Expert 8.06軟件響應(yīng)面分析程序?qū)ζ溥M(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：Y=9.22+0.041A+0.038B+0.010C－0.00008AB+0.010AC+0.0099BC－0.43A2－0.019B2－0.014C2，對(duì)二次模型進(jìn)行方程分析，結(jié)果如表6所示。模型P=0.0042＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.1595＞0.05，相關(guān)系數(shù)R2=96.38%，表明模型的相關(guān)性很好，R2Adj相關(guān)系數(shù)為89.85%，表明響應(yīng)面的89.85%的變化可以由此模型解釋，模型與實(shí)際情況擬合的很好。變異系數(shù)CV越低，試驗(yàn)的可信度和精確度越高，變異系數(shù)為0.18，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，因此可以用此回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表 6 模型回歸方程方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equations

由表6還可看出，在α=0.05的顯著水平上，A、B、及A2是顯著的，AC(低聚木糖和脯氨酸)及BC(菊糖和脯氨酸)有一定的交互作用，但均不顯著。利用Design-Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面的二維等高線和三維立體圖(圖5～7)，等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強(qiáng)，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡。由3組圖可知，增殖培養(yǎng)基中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)都有一個(gè)最大值，采用Design-Expert軟件的Optimization模塊，對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在各物質(zhì)實(shí)驗(yàn)添加量的范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)低聚木糖、菊糖及脯氨酸添加量分別為1.7、3.6、0.4g/L時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的最大值為9.2489。采用上述最優(yōu)添加量培養(yǎng)長(zhǎng)雙歧桿菌，實(shí)際獲得5組平行實(shí)驗(yàn)平均發(fā)酵液中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)為(1.75±0.02)×109CFU/mL，其對(duì)數(shù)值為9.244±0.006，與預(yù)測(cè)值接近，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵液中長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值。

圖 5 低聚木糖與菊糖對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.5 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and inulin on the growth of B. longum

圖 6 低聚木糖與脯氨酸對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.6 Surface and contour plots for the effect of xylooligosaccharide and proline on the growth of B. longum

圖 7 菊糖與脯氨酸對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.7 Surface and contour plots for the effect of inulin and proline on the growth of B. longum

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)證明，Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面方法(RSM)相結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地從眾多影響長(zhǎng)雙歧桿菌液體培養(yǎng)的因素中篩選出比較重要的影響因素，并實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化，得到最佳營(yíng)養(yǎng)，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際培養(yǎng)情況吻合較好。

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌的最佳碳源為乳糖，低聚木糖、菊糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖、苯丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酸及賴氨酸能顯著促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行了主要影響因子篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，主要影響因子為低聚果糖、菊糖及脯氨酸，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：將MRS中的碳源葡萄糖替換為乳糖20g/L，再加入低聚木糖1.7g/L、菊糖3.6g/L、脯氨酸0.4g/L和半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/L，37℃厭氧培養(yǎng)18h后其活菌數(shù)達(dá)(1.75±0.02)×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高了95.64%。

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