姜豐，王穎，湯華成，王憲青

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319）

番茄紅素（Lycopene）是植物中所含的一種天然色素，1903年被SCHUNDC 發(fā)現(xiàn)并命名為Lycopene。主要存在于番茄、西瓜、柿子、胡椒果、木瓜、芒果、番石榴、葡萄、茶的葉片及蘿卜、胡蘿卜、蕪菁、甘藍等的根部中。番茄紅色具有消除自由基和修復抗氧化能力[1-3]。 其抗癌防癌的功效突出，對于預防心血管疾病、動脈硬化等各種成人病[4]、增強人體免疫系統(tǒng)以及延緩衰老[5]等都具有重要意義。

目前，番茄紅素的生產(chǎn)工藝主要有三種，國內外多采用天然提取的方法，包括有機溶劑萃取和超臨界萃取，此外還有化學合成法和生物合成法[6]。采用生物合成法利用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素，與前兩種方法相比較，這種方法具有不受季節(jié)限制、操作工藝簡單、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本便宜，可相對的減少生產(chǎn)過程中污染的優(yōu)點，并且可以得到較高的番茄紅素得率，是實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)理想的一條途徑[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

三孢布拉霉正、負菌（武漢大學菌種保藏中心所）；番茄紅素（北京澳天茂森生物技術研究院）；黃豆粉、玉米粉等（大慶 沃爾瑪超市售）；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、咪唑、B-紫羅酮（天津法埃莎化學有限公司）；維生素B1（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器

AR2140 型分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；VIS-721 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；pH 計；DK-S11 電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；DZF-6200 45 ℃真空干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）；HNY-200B臺式恒溫搖床（北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司）；LC1200 安捷倫液相色譜儀（太原市醫(yī)達維科醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司）；YM50A 電熱式壓力蒸汽消毒器（上海滬粵明科學儀器有限公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 三孢布拉霉自身體內合成番茄紅素的途徑

三孢布拉霉通過利用葡萄糖等營養(yǎng)物質，在適宜的發(fā)酵條件作用下經(jīng)過一系列反應后可生成β-胡蘿卜素，而番茄紅素作為胡蘿卜素的母體化合物，要大量積累番茄紅素就必須將反應控制在番茄紅素水平，實驗通過改變三孢布拉霉的培養(yǎng)條件和添加抑制劑來抑制環(huán)化酶的活性，從而阻斷β-胡蘿卜素生成途徑的最后兩步環(huán)化反應，以積累大量的番茄紅素。

圖1 三孢布拉霉自身合成番茄紅素的途徑Fig.1 The pathway of autosynthesis Lycopene from Blakeslea trispora

1.3.2 菌種的活化

保藏菌種在無菌條件下接入PDA 培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3 種子培養(yǎng)基的配制

將三孢布拉霉正負菌甘油保藏樣為1∶10 的接種量接入PDA 培養(yǎng)基復蘇培養(yǎng)，27 ℃，180 rpm，培養(yǎng)44 h。穩(wěn)定傳代3 次待用。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

將對數(shù)生長期的正負菌按照1∶10 接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH 7.5，27 ℃發(fā)酵培養(yǎng)。24 h 后時加入發(fā)酵促進劑，42 h 時加入發(fā)酵阻斷劑，180 rpm 在旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)。

1.3.5 標準曲線的繪制及樣品中番茄紅素濃度的測定

分別準確稱取經(jīng)真空干燥的番茄紅素標準品0.7、1.3、1.9、2.6、3.0、3.9、4.1 mg，各在10 mL 容量瓶中用氯仿迅速溶解稀釋并加氯仿定容至刻度，搖勻，避光放置10 min，分別在721 型分光光度計上于518.8 nm 波長處，用1 cm 的比色皿，以氯仿作為參比，測得吸光度值，經(jīng)7 次平行測定，取其平均的結果。以吸光度A 為縱坐標，番茄紅素濃度C 為橫坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸。得回歸方程：

A=0.269 7 C+0.058 9，此方程的相關系數(shù)r=0.999 6。吸取樣品溶液1 mL 置于10 mL 容量瓶中，按上述方法測定樣液中吸光度值，帶入回歸方程，求得樣液中番茄紅素的濃度[8]。

2 結果與討論

2.1 不同碳源與氮源對番茄紅素產(chǎn)量的影響

碳源對番茄紅素發(fā)酵和菌體量的影響十分重要，主要用于構成菌絲體細胞物質和含氮的目的產(chǎn)物。在除碳源外其它成分不變的情況下，選取碳源濃度為1.8%的麥芽糖、葡萄糖、玉米粉、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源平行發(fā)酵的比較，結果如圖2 所示。在碳源濃度為1.8%的濃度時5 種碳源麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉對應的番茄紅素的產(chǎn)量分別為0.79、0.95、0.83、1.19、0.99 g·L-1。與同類的碳源相比較玉米粉作為碳源產(chǎn)番茄紅素的數(shù)值最高，并且玉米粉具有來源廣泛、價格便宜，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。因此選取濃度為1.8%的玉米粉作為發(fā)酵的最佳碳源。

圖2 不同碳源對番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the Lycopene production

在除碳源外其它成分不變的情況下，在氮源添加濃度為4.4%，黃豆粉、玉米漿粉、棉籽餅粉、豆餅粉、蛋白胨5 種氮源進行發(fā)酵，結果如圖3 所示。在氮源濃度為4.4%的濃度是5 種氮源黃豆粉、豆餅粉、棉籽餅粉、玉米粉、蛋白胨對應的番茄紅素的產(chǎn)量分別為1.1、0.9、1.00、1.05、0.80 g·L-1。數(shù)據(jù)表明添加一定濃度的黃豆粉和玉米粉作為氮源，霉菌產(chǎn)番茄紅素的量基本相同，但玉米粉作為氮源時菌液較為黏稠，主要以促進菌體生長為主，黃豆粉主要以促進番茄紅素合成為主，這可能是因為玉米粉中除含有蛋白質和游離的氨基酸外，還含有少量的糖類、脂肪、維生素及某些生長因子，促使霉菌的生長過快。因此選取濃度為4.4%的黃豆粉作為發(fā)酵的最佳氮源。

圖3 不同氮源對番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the Lycopene production

2.2 不同接種比例對番茄紅素產(chǎn)量的影響

番茄紅素的生產(chǎn)菌主要是負菌，正菌在生產(chǎn)中主要起到誘導作用，因此接種量的大小對番茄紅素發(fā)酵非常尤為重要。在當總的接種量不變時（20%），隨著正負菌的接種比例從1∶5 增加到1∶40，得到的結果如圖4 所示。在接種量為20%的情況下，按1∶10 混合后的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，所得到的番茄紅素產(chǎn)量最高為1.07 g·L-1。在接種比例為1∶5 時，菌體生長過于緩慢，不利于番茄紅素的積累，隨著接種比例在1∶10 后繼續(xù)增大，菌體生長過快，發(fā)酵液變黏稠，菌株無法呼吸而導致菌體過早自溶，因此選擇發(fā)酵的接種比例為1∶10。

圖4 不同接種比例對番茄紅素產(chǎn)量影響Fig.4 Effect of different inoculation ratio on the Lycopene production

2.3 發(fā)酵促進劑添加時間對番茄紅素產(chǎn)量的影響

β-紫羅酮是一種性激素，β-紫羅酮作為三孢酸的結構類似物，如果在發(fā)酵過程中添加，可以誘導類胡蘿卜素的合成。因此三孢布拉氏霉菌發(fā)酵過程中，在實驗中選用β-紫羅酮作為發(fā)酵的促進劑，實驗在發(fā)酵的12、24、36、48、60 h 時添加0.1%的β-紫羅酮，以番茄紅素產(chǎn)量為指標，得出最佳的促進劑的添加時間。結果如圖5 所示。

圖5 發(fā)酵促進劑添加時間對番茄紅素產(chǎn)量影響Fig.5 Effect of fermentation accelerator add time on the Lycopene production

在發(fā)酵過程中每隔12 h 向發(fā)酵液中添加濃度為0.7 mg·mL-1的β-紫羅酮，實驗數(shù)據(jù)表明：相對于空白對照，發(fā)酵12 h 加入β-紫羅酮，菌體量由1.01 g·L-1提高到1.13 g·L-1，提高了11.9%，發(fā)酵24 h 加入β-紫羅酮，菌體量由1.01 g·L-1提高到1.26 g·L-1，提高了24.7%，發(fā)酵36 h 加入β-紫羅酮，菌體量由1.01 g·L-1提高到1.17 g·L-1，提高了15.8%，發(fā)酵48 h 加入β-紫羅酮，菌體量由1.01 g·L-1下降到0.95 g·L-1，發(fā)酵60 h 加入β-紫羅酮，菌體量由1.01 g·L-1下降到0.71 g·L-1。因此在發(fā)酵后的24 h添加0.1%的β-紫羅酮可使番茄紅素的產(chǎn)量提高的程度最高為24.7%。實驗結果與文獻報道基本一致。

2.4 發(fā)酵阻斷劑添加時間對番茄紅素產(chǎn)量的影響

三孢布拉氏霉菌在發(fā)酵的過程中，添加含氮類雜環(huán)化合物會阻斷類胡蘿卜素合成代謝途徑中的番茄紅素環(huán)化反應，可以積累大量的番茄紅素。因此在發(fā)酵的過程中阻斷劑的添加時間對最后番茄紅素的產(chǎn)量最為重要，通過查閱大量的文獻表明在含氮類雜環(huán)化合物中咪唑的阻斷效果最好，實驗分別選擇在發(fā)酵30、42、48、54、66 h 向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度為0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄紅素產(chǎn)量作為考察指標[9]。結果如圖6 所示：不同時間段添加濃度為0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄紅素產(chǎn)量分別為0.82、0.96、1.22、1.04、0.87 g·L-1。發(fā)酵進行到42 h 時添加濃度為0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄紅素的產(chǎn)量最高。在18、32 h 加入咪唑阻斷劑番茄紅素的產(chǎn)量較低，這可能是由于過早的加入阻斷劑對菌體產(chǎn)生了毒害的作用，不利于菌體的生長，致使番茄紅素的產(chǎn)量較低，在48、54 h 時加入咪唑阻斷劑番茄紅素產(chǎn)量偏低，這可能是因為阻斷劑的加入過晚，沒有發(fā)揮阻斷作用，一部分的番茄紅素合成了β-胡蘿卜素。因此選擇發(fā)酵進行到42 h 時添加濃度為0.7 mg·mL-1的咪唑阻斷劑。

圖6 發(fā)酵阻斷劑添加時間對番茄紅素產(chǎn)量影響Fig.6 Effect of fermentation blockers add time on the Lycopene production

2.5 單因素試驗

2.5.1 不同發(fā)酵pH 值對番茄紅素產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵的過程中培養(yǎng)液的pH 值是一項重要的發(fā)酵參數(shù)，微生物的生長和生物的合成都有其最適和能夠耐受的pH 范圍，因此pH 值對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響，為了達到最高的生長速率和最多的番茄紅素的積累，實驗選取pH 為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 5 個pH 值。選擇一個合適的pH 值并使其在很窄的范圍內保持穩(wěn)定。結果如圖7 所示。pH 從6.5 增加到7.5 時番茄紅素的產(chǎn)量隨著pH 的升高而升高，pH 從7.5 增加到8.5 時番茄紅素的產(chǎn)量隨著pH 的升高反而降低。這可能是因為霉菌有其最大的耐受pH 范圍，超過這個范圍后，霉菌的菌絲形態(tài)發(fā)生了改變或者引起膜的滲透性發(fā)生改變，進而影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收和代謝產(chǎn)物的形成。因此選擇7.5 作為實驗發(fā)酵的最佳pH 值。

圖7 不同發(fā)酵pH 值對番茄紅素產(chǎn)量影響Fig.7 Effect of different fermentation pH value on the Lycopene production

2.5.2 不同發(fā)酵溫度對番茄紅素產(chǎn)量的影響

根據(jù)酶促反應的動力學，發(fā)酵的溫度與酶的活性密切相關，因此選擇合適的發(fā)酵溫度對于番茄紅素的產(chǎn)量有很大的影響。實驗選擇25、26、27、28、29 ℃溫度進行發(fā)酵，結果如圖8 所示。但溫度從25 ℃增加到27 ℃時，番茄紅素的產(chǎn)量隨著溫度的升高而升高，到27 ℃時達到最高為1.18 g·L-1，這可能是因為隨著發(fā)酵溫度的升高，細胞的呼吸強度增強，細胞的生長繁殖加快，致使番茄紅素產(chǎn)量增加。27 ℃以后隨著溫度的增加番茄紅素的產(chǎn)量反而下降，這可能是因為溫度過高酶失活的速度加快，細胞提前加速衰老，發(fā)酵的周期縮短，致使番茄紅素的產(chǎn)量變少。因此實驗選擇27 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖8 不同發(fā)酵溫度對番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of different fermentation temperature on the Lycopene production

圖9 發(fā)酵時間對番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the Lycopene production

2.5.3 發(fā)酵時間對番茄紅素產(chǎn)量的影響

微生物發(fā)酵時間對次級代謝產(chǎn)物的合成具有十分重要的影響作用，發(fā)酵時間過短，次級代謝產(chǎn)物合成還沒有徹底完成，無法生成番茄紅素。長時間的發(fā)酵會造成菌體自溶并使發(fā)酵成本過高。實驗分別選擇96、108、120、132、144 h 作為發(fā)酵結束時間，得出最優(yōu)的發(fā)酵結束時間以積累大量的番茄紅素，結果如圖9 所示。可以發(fā)現(xiàn)在96～120 h 的時間段內，隨發(fā)酵時間的延長，番茄紅素的生成量逐漸增加。番茄紅素的生成量在發(fā)酵進行120 h 后達到最大值1.22 g·L-1；在發(fā)酵120～144 h，番茄紅素的產(chǎn)量反而下降，這可能是因為霉菌的發(fā)酵時間過長產(chǎn)生了有毒物質，造成菌體的自溶，致使番茄紅素產(chǎn)量降低。故實驗選用120 h 作為最佳發(fā)酵時間。

3 結論

實驗最優(yōu)的發(fā)酵條件為：碳源和氮源分別為玉米粉和黃豆粉，正負菌接種比例1∶10，發(fā)酵溫度為27 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基pH 值為7.5，發(fā)酵時間為120 h、發(fā)酵后的24 h 添加發(fā)酵促進劑β-紫羅酮，發(fā)酵后的42 h 添加發(fā)酵阻斷劑咪唑，此條件得到的番茄紅素產(chǎn)量為最高。與其他方法相比較，此方法具有不受季節(jié)地理的影響、工藝簡單、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，實驗找到了各因素的最佳值以獲得較理想的番茄紅素得率，對實際生產(chǎn)有指導意義，番茄紅素作為功能性天然色素在醫(yī)藥、食品、化妝品中必將擁有廣闊的應用前景和廣闊的市場前景[10]，因此具有一定的發(fā)展前途。

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