劉雙，程建華，韓釗，楊金龍，程朝暉，候圣陶

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腦血管科，浙江 溫州 325000；2.加拿大國(guó)家科學(xué)院生物科學(xué)研究所，渥太華）

姜黃素是姜科姜黃屬植物的根莖（中醫(yī)又稱莪術(shù)）的主要成分。早期研究表明姜黃素具有抗氧化、抗血腦屏障損傷和抗凋亡作用[1-3]，因此，推測(cè)姜黃素對(duì)于腦缺血損傷可能具有一定的保護(hù)作用。2008年，Kim等[4]在體外實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)ERK和P38MAK介導(dǎo)機(jī)制能促進(jìn)神經(jīng)元再生，但姜黃素對(duì)在體的神經(jīng)干細(xì)胞增殖是否有影響鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物，能選擇性地?fù)饺氲教幱诩?xì)胞周期S期（DNA合成期）細(xì)胞的單鏈DNA核苷酸序列中，BrdU免疫組化染色在神經(jīng)生物學(xué)中成為研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的重要方法。本研究采用連續(xù)腹腔給藥的方法觀察姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以及用BrdU免疫組化染色觀察姜黃素對(duì)腦缺血后新生神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 激光共聚焦顯微鏡（日本，Olympus FV1000）；圖像分析軟件（Image J）；姜黃素、BrdU、玉米油及TTC（美國(guó)，Sigma公司）；綿羊抗大鼠BrdU一抗（美國(guó)，Abcam公司）；TRITC熒光二抗（美國(guó)，Jackson ImmunoResearch）；線栓（北京沙龍生物技術(shù)有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只健康雄性大鼠，體質(zhì)量250～280 g，平均（270±10）g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=10），假手術(shù)組（n=10），模型對(duì)照組（n=10），姜黃素給藥組（n=10），大鼠于手術(shù)前自由飲水、飲食5 d，保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，以日光采光，明暗周期各12 h，保持室溫在18～22 ℃之間。大鼠在缺血再灌注損傷后1 h立即給予腹腔注射用藥：姜黃素給藥組給予姜黃素注射，其注射劑量為300 mg/kg，其余各組給予等劑量的注射用玉米油，用于免疫熒光檢測(cè)的各組大鼠在處死前3 d每天按照50 mg/kg的劑量給予BrdU腹腔注射給藥，每天兩次。

1.3 大鼠MCAO模型制作 參照Z(yǔ)ea Longa線栓法[5]再加以改進(jìn)，以左側(cè)大腦栓塞為例。大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。頸總動(dòng)脈打一活結(jié)，在頸外動(dòng)脈離心端1 cm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，然后在頸外動(dòng)脈上切一小切口，將線栓插入后剪短頸外動(dòng)脈，之后將線栓沿著頸內(nèi)動(dòng)脈入顱的方向插入，當(dāng)插入約距頸總動(dòng)脈分叉處18～20 mm左右時(shí)感到一輕微阻力時(shí)便立即停止插入，即表明已經(jīng)阻塞住大腦中動(dòng)脈。阻斷120 min后，將線栓拔出，解除頸總動(dòng)脈活結(jié)，貫通頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈通路。完成腦缺血再灌注損傷的模型。假手術(shù)組將線栓插入10 mm，其余均與上述手術(shù)步驟相同。

模型成功評(píng)價(jià)指標(biāo)：①右側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；②提尾倒懸時(shí)右上肢向胸前屈曲；③行走時(shí)向右側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈；④左側(cè)出現(xiàn)Horner’s征。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)測(cè)定 參照Longa 5級(jí)4分法，神經(jīng)功能評(píng)分采用單盲法，在動(dòng)物模型制作后的24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向病灶對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識(shí)喪失。其中0分和4分者剔除試驗(yàn)，1～3分者納入實(shí)驗(yàn)范圍。

1.5 標(biāo)本采集 連續(xù)給藥7 d后，每組各5只大鼠10%水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦，放于-20 ℃冰箱2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色備用。各組剩余大鼠經(jīng)過(guò)心臟10%氯化鈉溶液灌注后放于4%的多聚甲醛中4 ℃固定12 h后常規(guī)脫水、透明、浸蠟后，連續(xù)4μm的冠狀切片，用于后續(xù)的免疫熒光的檢測(cè)。

1.6 腦梗死體積的測(cè)定 從-20 ℃中取出腦組織，間隔2 mm連續(xù)行5個(gè)的冠狀切片，將組織切片置于TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光、恒溫孵育15 min，梗死灶染成白色，正常組織染成紅色，數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理，計(jì)算出梗死灶面積，按公式：V=（A1+A2+……+An）t-（A1+An）t/2計(jì)算腦梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積[6]。

1.7 免疫熒光檢測(cè)BrdU的表達(dá) 做厚度為4μm的切片，利用免疫熒光的檢測(cè)方法檢測(cè)大腦梗死側(cè)側(cè)腦室下區(qū)的BrdU的表達(dá)。首先，石蠟切片脫蠟水化：在二甲苯中脫蠟30 min后放入梯度酒精中水化。其次，枸櫞酸高壓抗原修復(fù)3 min，自然降至室溫。PBS沖洗后將切片置于2 mol/L的HCl中冰上孵育10 min，室溫下孵育10 min，37 ℃下孵育20 min后直接置于0.1 mol/L的硼酸中中和10 min。最后，PBS沖洗后滴加BrdU一抗（1:50），室溫孵育1 h后4 ℃孵育過(guò)夜，16 h后滴加四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記的熒光二抗，室溫下放置30 min后利用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗的孵育，其他步驟與上述步驟相同。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部數(shù)據(jù)以±s表示，單因素方差分析采用one-way ANOVA，方差齊性組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊組間比較采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 局灶性缺血再灌注損傷24 h后，大鼠有不同程度的神經(jīng)功能缺損，模型對(duì)照組的癥狀較為嚴(yán)重，而空白對(duì)照組及假手術(shù)組沒(méi)有癥狀出現(xiàn)。姜黃素給藥組神經(jīng)功能評(píng)分與模型對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。

圖1 姜黃素給藥組和模型對(duì)照組的神經(jīng)功能評(píng)分

2.2 腦梗死體積測(cè)定 空白對(duì)照組與假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶，模型對(duì)照組與姜黃素給藥組出現(xiàn)不同程度的梗死灶，其中給藥組的梗死灶體積小于模型組的梗死灶體積，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

表1 四組腦梗死體積測(cè)定和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n=10，±s）

表1 四組腦梗死體積測(cè)定和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（n=10，±s）

與模型對(duì)照組比：aP＜0.01

組別空白對(duì)照組假手術(shù)組模型對(duì)照組姜黃素給藥組梗死體積測(cè)定（mm3）00 155.6±11.26 67.8±11.05a BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）5.1±1.21 6.2±3.12 21.0±5.23 50.6±12.60a

2.3 BrdU免疫熒光 BrdU陽(yáng)性細(xì)胞為紅色熒光TRITC標(biāo)記的細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在梗死灶的周?chē)？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組僅有少量的陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，而模型對(duì)照組和姜黃素給藥組有大量的陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。同模型對(duì)照組相比，姜黃素給藥組的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量更多，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)表1，圖2）。

圖2 側(cè)腦室下區(qū)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)（×400）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在局灶性腦缺血再灌注損傷后1 h，給予姜黃素腹腔注射治療后能夠顯著減小給藥組的腦梗死體積，并能增加缺血側(cè)側(cè)腦室下區(qū)的新生神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，并能促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞再生。

腦保護(hù)劑的研究作為神經(jīng)生物的一大研究熱點(diǎn)、難點(diǎn)，越來(lái)越受到研究者的關(guān)注，但眾多應(yīng)用于臨床上的腦保護(hù)劑并未再現(xiàn)其在實(shí)驗(yàn)研究階段的腦保護(hù)效果。因此，在研究姜黃素的腦保護(hù)作用時(shí)，我們采用更符合臨床用藥規(guī)律的給藥方式，將姜黃素的給藥持續(xù)時(shí)間延續(xù)到7 d，采用神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分以及TTC染色來(lái)確定姜黃素連續(xù)腹腔注射7 d的腦保護(hù)作用效果。從TTC染色的結(jié)果我們可以看出，空白對(duì)照組、假手術(shù)的大鼠未見(jiàn)任何梗死灶，而模型對(duì)照組梗死灶體積較大，同模型對(duì)照組相比，姜黃素給藥組的梗死灶體積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們推斷姜黃素在腦缺血再灌注損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用。從神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分上我們可以看出空白對(duì)照組、假手術(shù)組的SD大鼠神經(jīng)功能完全正常，姜黃素給藥組的神經(jīng)功能評(píng)分同模型對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但亦呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明神經(jīng)缺損癥狀有所改善，神經(jīng)功能有所恢復(fù)。評(píng)分結(jié)果差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因我們分析：Longa 4分制的神經(jīng)功能評(píng)分具有一定的局限性，其評(píng)分要素僅僅局限于運(yùn)動(dòng)功能的改變，而對(duì)于感覺(jué)功能，反射能力等變化并未涉及，因此不能完全說(shuō)明腦缺血損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。這也提示我們?cè)谂R床上的神經(jīng)功能恢復(fù)的判斷，采用綜合的判斷方式才更為精確。

BrdU，作為神經(jīng)新生細(xì)胞有絲分裂的主要標(biāo)記物之一[7]，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于神經(jīng)生物學(xué)的研究當(dāng)中。BrdU是DNA中胸腺嘧啶的類(lèi)似物，在DNA合成的S期插入到細(xì)胞周期當(dāng)中，所以一旦新生細(xì)胞進(jìn)行此步合成，研究者就可以運(yùn)用免疫學(xué)等方法檢測(cè)到新生細(xì)胞的表達(dá)[8]。因此，我們采用BrdU作為新生神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出成年SD大鼠在未受任何刺激的情況下存在神經(jīng)再生的現(xiàn)象，這也間接證實(shí)了2000年Gage[9]闡述的哺乳類(lèi)動(dòng)物在整個(gè)成年期都存在神經(jīng)新生的推斷。從模型對(duì)照組我們也可以看出腦缺血再灌注損傷的有效刺激后SD大鼠的神經(jīng)再生數(shù)目顯著增多，同空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而姜黃素給藥組同模型對(duì)照組相比數(shù)量更多，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示我們姜黃素能夠促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)再生，有可能是姜黃素的腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。但姜黃素與神經(jīng)再生的研究還比較粗淺，在本實(shí)驗(yàn)中我們測(cè)定了BrdU標(biāo)記的新生神經(jīng)細(xì)胞情況，但新生的神經(jīng)細(xì)胞其遷移、分化情況還需要進(jìn)一步的研究，故對(duì)于新生神經(jīng)細(xì)胞我們還應(yīng)采用更多的標(biāo)記方式標(biāo)記它的成熟、分化程度，同時(shí)觀察其遷移趨勢(shì)，以便證實(shí)這些新生細(xì)胞是否真正發(fā)揮其功能，對(duì)腦缺血損傷是否具有修復(fù)功能。同時(shí)，神經(jīng)新生的部位主要發(fā)生在兩個(gè)區(qū)域，側(cè)腦室下區(qū)（SVZ區(qū)）和齒狀回下區(qū)（DG區(qū)）[10]，因此在今后的研究當(dāng)中我們需要對(duì)兩個(gè)部位同時(shí)進(jìn)行觀察，以便得出更精確的結(jié)論。

[1] Yang C, Zhang X, Fan H, et al. Curcumin upregulates transcription factor Nrf2, HO-1 expression and protects rat brains against focal ischemia[J]. Brain Res, 2009, 1282:133-141.

[2] Jiang J, Wang W, Sun YJ, et al. Neuroprotective effect of curcumin on focal cerebral ischemic rats by preventing bloodbrain barrier damage[J]. Eur J Pharmacol, 2007, 561(1-3):54-62.

[3] Zhao J, Zhao Y, Zheng W, et al. Neuroprotective effect of curcumin on transient focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res, 2008, 1229:224-232.

[4] Kim SJ, Son TG, Park HR, et al. Curcumin stimulates proliferation of embryonic neural progenitor cells and neurogenesis in the adult hippocampus[J]. J Biol Chem, 2008, 283(21):14497-14505.

[5] 楊金龍, 程朝輝, 劉雙, 等. 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012(2):129-131.

[6] 張鴻, 劉艷艷, 賈春紅, 等. 吡那地爾對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2008(2):167-170.

[7] Gratzner HG. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication[J]. Science, 1982, 218(4571):474-475.

[8] del Rio JA, Soriano E. Immunocytochemical detection of 5'-bromodeoxyuridine incorporation in the central nervous system of the mouse[J]. Brain Res Dev Brain Res,1989, 49(2):311-317.

[9] Gage FH. Mammalian neural stem cells[J]. Science, 2000,287(5457):1433-1438.

[10]Taupin P, Gage FH. Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals[J]. J Neurosci Res, 2002, 69(6):745-749.