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        干擾素γ對大鼠肺纖維化轉(zhuǎn)錄因子GATA3的影響

        2013-07-27 05:53:56涂軍偉趙建平朱景倩盛琳章義利
        關(guān)鍵詞:肺纖維化肺泡細(xì)胞因子

        涂軍偉,趙建平,朱景倩,盛琳,章義利

        (1.金華市中心醫(yī)院 呼吸科,浙江 金華 321000;2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 ICU,浙江 溫州325000)

        近來有研究表明轉(zhuǎn)錄因子GATA3在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[1]。有研究表明,干擾素γ(IFN-γ)對人和動物的肺纖維化有一定的防治作用,但機(jī)制仍不明了。本研究檢測大鼠肺纖維化模型外周血單個核細(xì)胞(PMBC)GATA3 mRNA的表達(dá),從而探討IFN-γ干預(yù)肺纖維化的機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 材料 健康雄性SD大鼠70只(由金華市藥檢所提供),體質(zhì)量195~305 g,平均(250±50)g;博萊霉素(BLM)A5粉針(哈爾濱博萊制藥有限公司,H23021807);IFN-γ針,大鼠干擾素-γELISA Kit(上海晶美生物技術(shù)有限公司);寶生物 rTaq酶及配套試劑;GATA3引物及探針均由上?;倒竞铣?,序列如下:正向引物:5’-CACAGAAGGCAGGGAGTGTGT-3’,反向引物:5’-CAGGCGTTGCAAAGGT AGTG-3’,TaqMan探針:5’-FAM-TACCCCACTGTGGCGGC GAGA-TAMRA-3’,長度均為90 bp。

        1.2 方法

        1.2.1 模型的建立及分組:雄性SD大鼠隨機(jī)方法分為正常對照組(C組)10只、BLM組30只、BLMIFN組30只。BLM組以腹腔內(nèi)給藥法復(fù)制大鼠肺纖維化模型[1],即每日腹腔內(nèi)注射15 mg/kg BLM共10 d;對照組每日腹腔內(nèi)給予0.1 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液共10 d。BLM組分別于造模的第7天、第14天、第28天各處死10只(相應(yīng)為BLM1、BLM2、BLM4組);BLM-IFN組在BLM造模后當(dāng)天開始以IFN-γ肌肉注射,劑量為15萬IU·kg-1·d-1,直至實(shí)驗(yàn)全程結(jié)束,分別在第7天、第14天、第28天各處死大鼠10只(相應(yīng)為BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4組)。

        1.2.2 動物的處死和標(biāo)本的收集:各組大鼠行頸動脈放血處死,分離出氣管和肺,左下肺用手術(shù)線結(jié)扎,取左下肺置于10%中性甲醛溶液中浸泡固定,經(jīng)脫水,石蠟包埋切片,按常規(guī)程序行HE染色,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

        1.2.3 肺組織病理組織學(xué)檢查:按Maeyama[1]方法:在光鏡(4×10)下評估每張切片上肺泡炎和肺纖維化的面積,分成0、I、II、III級,分別對應(yīng)分值0分、1分、2分、3分,具體標(biāo)準(zhǔn)如下:0級,肺組織結(jié)構(gòu)正常,無肺泡炎和肺纖維化;I級,肺泡炎和肺纖維化累及肺組織<25%;II級,肺泡炎和肺纖維化累及肺組織25%~50%;III級肺泡炎和肺纖維化累及肺組織>50%。

        1.2.4 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測:取大鼠靜脈血1.5 mL,梯度離心法分離PMBC,使用Bio-Rad Nucleospin RNA Pu-rification Kit進(jìn)行總RNA抽提,操作流程按試劑盒說明書進(jìn)行。一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,取總RNA 2μg,Oligo(dT)15 2μL,加DEPC水至18μL,混勻、離心后70 ℃ 5 min中止反應(yīng),冰水浴 3 min;體系中繼續(xù)加入5×M-MLV Buffer 8μL,10 mmol/L dNTP 2μL,40 U/μL RNasin 1μL,200 U/μL M-MLV 2μL,總體積40 μL。混勻、離心后42 ℃ 60 min中止反應(yīng),95 ℃10 min,產(chǎn)物-18 ℃保存?zhèn)溆?。采用TaqMan PCR探針法進(jìn)行。反應(yīng)體系如下:20 mol/L TaqMan Probe 0.625μL,20 mol/L primer forward 1.125μL,20 mol/L primer reverse 1.125μL,H2O 7.625 μL,ABI TaqMan 2 PCR Mas-ter mix 12.5μL,Template 2μL,總體積25μL。每次檢測設(shè)置3個NTC(No Template Control)。把制備好的待測樣品加入96孔板中,每個樣品進(jìn)行3個平行樣實(shí)驗(yàn),PCR反應(yīng)程序如下:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;進(jìn)入循環(huán):95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參,將待測基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值作為ΔCt值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。病理半定量資料采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 肺病理組織學(xué)改變 C組肺組織結(jié)構(gòu)正常(見圖1);BLM組1周時以肺泡炎為主,肺泡間隔增寬,肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有較多的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,伴有水腫和輕度出血(見圖2);2周時肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞減少,成纖維細(xì)胞增多,肺泡間隔增寬(見圖3),BLM1與BLM2二組病理結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4周時以肺纖維化為主,肺泡壁增厚,部分肺泡腔消失,肺泡結(jié)構(gòu)破壞(見圖4),BLM1與BLM4二組病理結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在使用BLM致大鼠肺纖維化時同時加用外源性IFN-γ治療,則大鼠肺組織病理變化表現(xiàn)不同,BLM-INF1組與BLM1組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),仍以肺泡炎為主,但在BLM-INF2及BLM-INF4組中發(fā)現(xiàn)肺纖維化程度減輕(見圖5),與BLM組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),而C組和BLM各組及BLM-INF各組病理學(xué)對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。各組大鼠肺組織病理半定量分析見表1。

        2.2 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測表明各BLM組△Ct-GATA3值(BLM1、BLM2、BLM4各組△Ct-GATA3值分別為11.36±0.52、8.38±0.68、8.39±0.52)均低于C組(11.99±1.14)(均P<0.01),BLM4組及BLM2組的△Ct-GATA3值均低于BLM1組(均P<0.01),但BLM4組與BLM2組兩組間的△Ct-GATA3值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示BLM使GATA3基因的表達(dá)在初始的2周內(nèi)顯著增高。BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4各組△Ct-GATA3值分別是12.14±0.40、13.74±0.43、12.93±0.51,IFN-γ干預(yù)第1周時,和BLM1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但在第2周以后,大鼠GATA3基因表達(dá)則顯著減少,甚至低于C組(P<0.01)。

        圖1 SD大鼠肺組織正常光鏡下表現(xiàn)(4×10)

        圖2 BLM誘導(dǎo)1周時,大單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,肺泡間隔少許纖維組織增生,間隔增寬(10×20)

        圖3 BLM誘導(dǎo)2周時,纖維組織增生,單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增寬(較典型的中度肺纖維化病理改變)(10×10)

        表1 大鼠肺組織病理半定量分析

        3 討論

        肺纖維化是一種發(fā)展隱匿、進(jìn)展迅速、病死率和致殘率高且治療效果欠佳的慢性肺部疾病,尋找有效的治療方法及藥理學(xué)機(jī)制是目前該疾病研究的一個熱點(diǎn)。

        本實(shí)驗(yàn)利用BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型,起初1周內(nèi)表現(xiàn)為肺的炎癥細(xì)胞浸潤,纖維化成分較少,2周后纖維化成分增多而炎癥細(xì)胞消退,與有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]相似。雖然肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但目前認(rèn)為主要與Thl/Th2型細(xì)胞因子比例失衡密切相關(guān)[3-4]。轉(zhuǎn)錄因子GATA3是一種相對分子質(zhì)量為30000 Da的蛋白質(zhì),主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞,少數(shù)由嗜酸性粒細(xì)胞合成,在肺纖維化疾病的發(fā)生中也有重要意義[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺纖維化時GATA3顯著升高,也提示GATA3在肺纖維化過程中起重要作用,其可能的機(jī)制是GATA3僅在Th2中特異性表達(dá),通過IL-4/STAT6(信號轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄活化因子6)使GATA3表達(dá)增加。活化的GATA3進(jìn)入細(xì)胞核,導(dǎo)致IL-4基因座位染色質(zhì)重構(gòu),增加Th2類細(xì)胞因子(如IL-4和IL-5)產(chǎn)生,下調(diào)STAT4及IL-12β鏈?zhǔn)荏w表達(dá),從而促進(jìn)Th2分化,抑制Thl分化,表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢型變化[5-7]。研究表明肺纖維化時患者血清IFN-γ顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示外源給予IFN-γ能顯著改善肺纖維化程度,降低GATA3基因的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)業(yè)已優(yōu)勢化Th2的激活,恢復(fù)Th1/Th2的平衡,減緩肺纖維化的發(fā)展,這為IFN-γ治療肺纖維化提供了一個理論依據(jù)。

        圖4 BLM誘導(dǎo)4周時,肺泡腔內(nèi)纖維機(jī)化,多種炎癥細(xì)胞浸潤(重度肺纖維化表現(xiàn))(10×20)

        圖5 BLM+IFN 2周時,輕度纖維化(10×10)

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