涂軍偉，趙建平，朱景倩，盛琳，章義利

（1.金華市中心醫(yī)院 呼吸科，浙江 金華 321000；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 ICU，浙江 溫州325000）

近來有研究表明轉(zhuǎn)錄因子GATA3在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[1]。有研究表明，干擾素γ（IFN-γ）對人和動物的肺纖維化有一定的防治作用，但機(jī)制仍不明了。本研究檢測大鼠肺纖維化模型外周血單個核細(xì)胞（PMBC）GATA3 mRNA的表達(dá)，從而探討IFN-γ干預(yù)肺纖維化的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠70只（由金華市藥檢所提供），體質(zhì)量195～305 g，平均（250±50）g；博萊霉素（BLM）A5粉針（哈爾濱博萊制藥有限公司，H23021807）；IFN-γ針，大鼠干擾素-γELISA Kit（上海晶美生物技術(shù)有限公司）；寶生物 rTaq酶及配套試劑；GATA3引物及探針均由上?；倒竞铣?，序列如下：正向引物：5’-CACAGAAGGCAGGGAGTGTGT-3’，反向引物：5’-CAGGCGTTGCAAAGGT AGTG-3’，TaqMan探針：5’-FAM-TACCCCACTGTGGCGGC GAGA-TAMRA-3’，長度均為90 bp。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組：雄性SD大鼠隨機(jī)方法分為正常對照組（C組）10只、BLM組30只、BLMIFN組30只。BLM組以腹腔內(nèi)給藥法復(fù)制大鼠肺纖維化模型[1]，即每日腹腔內(nèi)注射15 mg/kg BLM共10 d；對照組每日腹腔內(nèi)給予0.1 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液共10 d。BLM組分別于造模的第7天、第14天、第28天各處死10只（相應(yīng)為BLM1、BLM2、BLM4組）；BLM-IFN組在BLM造模后當(dāng)天開始以IFN-γ肌肉注射，劑量為15萬IU·kg-1·d-1，直至實(shí)驗(yàn)全程結(jié)束，分別在第7天、第14天、第28天各處死大鼠10只（相應(yīng)為BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4組）。

1.2.2 動物的處死和標(biāo)本的收集：各組大鼠行頸動脈放血處死，分離出氣管和肺，左下肺用手術(shù)線結(jié)扎，取左下肺置于10%中性甲醛溶液中浸泡固定，經(jīng)脫水，石蠟包埋切片，按常規(guī)程序行HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.3 肺組織病理組織學(xué)檢查：按Maeyama[1]方法：在光鏡（4×10）下評估每張切片上肺泡炎和肺纖維化的面積，分成0、I、II、III級，分別對應(yīng)分值0分、1分、2分、3分，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，肺組織結(jié)構(gòu)正常，無肺泡炎和肺纖維化；I級，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＜25%；II級，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織25%～50%；III級肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＞50%。

1.2.4 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測：取大鼠靜脈血1.5 mL，梯度離心法分離PMBC，使用Bio-Rad Nucleospin RNA Pu-rification Kit進(jìn)行總RNA抽提，操作流程按試劑盒說明書進(jìn)行。一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取總RNA 2μg，Oligo(dT)15 2μL，加DEPC水至18μL，混勻、離心后70 ℃ 5 min中止反應(yīng)，冰水浴 3 min；體系中繼續(xù)加入5×M-MLV Buffer 8μL，10 mmol/L dNTP 2μL，40 U/μL RNasin 1μL，200 U/μL M-MLV 2μL，總體積40 μL。混勻、離心后42 ℃ 60 min中止反應(yīng)，95 ℃10 min，產(chǎn)物-18 ℃保存?zhèn)溆?。采用TaqMan PCR探針法進(jìn)行。反應(yīng)體系如下：20 mol/L TaqMan Probe 0.625μL，20 mol/L primer forward 1.125μL，20 mol/L primer reverse 1.125μL，H2O 7.625 μL，ABI TaqMan 2 PCR Mas-ter mix 12.5μL，Template 2μL，總體積25μL。每次檢測設(shè)置3個NTC（No Template Control）。把制備好的待測樣品加入96孔板中，每個樣品進(jìn)行3個平行樣實(shí)驗(yàn)，PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；進(jìn)入循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，將待測基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值作為ΔCt值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。病理半定量資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺病理組織學(xué)改變 C組肺組織結(jié)構(gòu)正常（見圖1）；BLM組1周時以肺泡炎為主，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有較多的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，伴有水腫和輕度出血（見圖2）；2周時肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞減少，成纖維細(xì)胞增多，肺泡間隔增寬（見圖3），BLM1與BLM2二組病理結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4周時以肺纖維化為主，肺泡壁增厚，部分肺泡腔消失，肺泡結(jié)構(gòu)破壞（見圖4），BLM1與BLM4二組病理結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在使用BLM致大鼠肺纖維化時同時加用外源性IFN-γ治療，則大鼠肺組織病理變化表現(xiàn)不同，BLM-INF1組與BLM1組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），仍以肺泡炎為主，但在BLM-INF2及BLM-INF4組中發(fā)現(xiàn)肺纖維化程度減輕（見圖5），與BLM組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而C組和BLM各組及BLM-INF各組病理學(xué)對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。各組大鼠肺組織病理半定量分析見表1。

2.2 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測 PMBC轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA的表達(dá)檢測表明各BLM組△Ct-GATA3值（BLM1、BLM2、BLM4各組△Ct-GATA3值分別為11.36±0.52、8.38±0.68、8.39±0.52）均低于C組（11.99±1.14）（均P＜0.01），BLM4組及BLM2組的△Ct-GATA3值均低于BLM1組（均P＜0.01），但BLM4組與BLM2組兩組間的△Ct-GATA3值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示BLM使GATA3基因的表達(dá)在初始的2周內(nèi)顯著增高。BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4各組△Ct-GATA3值分別是12.14±0.40、13.74±0.43、12.93±0.51，IFN-γ干預(yù)第1周時，和BLM1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在第2周以后，大鼠GATA3基因表達(dá)則顯著減少，甚至低于C組（P＜0.01）。

圖1 SD大鼠肺組織正常光鏡下表現(xiàn)（4×10）

圖2 BLM誘導(dǎo)1周時，大單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡間隔少許纖維組織增生，間隔增寬（10×20）

圖3 BLM誘導(dǎo)2周時，纖維組織增生，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬（較典型的中度肺纖維化病理改變）（10×10）

表1 大鼠肺組織病理半定量分析

3 討論

肺纖維化是一種發(fā)展隱匿、進(jìn)展迅速、病死率和致殘率高且治療效果欠佳的慢性肺部疾病，尋找有效的治療方法及藥理學(xué)機(jī)制是目前該疾病研究的一個熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)利用BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型，起初1周內(nèi)表現(xiàn)為肺的炎癥細(xì)胞浸潤，纖維化成分較少，2周后纖維化成分增多而炎癥細(xì)胞消退，與有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]相似。雖然肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但目前認(rèn)為主要與Thl/Th2型細(xì)胞因子比例失衡密切相關(guān)[3-4]。轉(zhuǎn)錄因子GATA3是一種相對分子質(zhì)量為30000 Da的蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞，少數(shù)由嗜酸性粒細(xì)胞合成，在肺纖維化疾病的發(fā)生中也有重要意義[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺纖維化時GATA3顯著升高，也提示GATA3在肺纖維化過程中起重要作用，其可能的機(jī)制是GATA3僅在Th2中特異性表達(dá)，通過IL-4/STAT6（信號轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄活化因子6）使GATA3表達(dá)增加。活化的GATA3進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致IL-4基因座位染色質(zhì)重構(gòu)，增加Th2類細(xì)胞因子（如IL-4和IL-5）產(chǎn)生，下調(diào)STAT4及IL-12β鏈?zhǔn)荏w表達(dá)，從而促進(jìn)Th2分化，抑制Thl分化，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢型變化[5-7]。研究表明肺纖維化時患者血清IFN-γ顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示外源給予IFN-γ能顯著改善肺纖維化程度，降低GATA3基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)業(yè)已優(yōu)勢化Th2的激活，恢復(fù)Th1/Th2的平衡，減緩肺纖維化的發(fā)展，這為IFN-γ治療肺纖維化提供了一個理論依據(jù)。

圖4 BLM誘導(dǎo)4周時，肺泡腔內(nèi)纖維機(jī)化，多種炎癥細(xì)胞浸潤（重度肺纖維化表現(xiàn)）（10×20）

圖5 BLM+IFN 2周時，輕度纖維化（10×10）

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