萬麗，羅旭，辛國華，李安樂，曾逃方，夏衛(wèi)東，李校堃，林才

（1.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 燒傷科，浙江 溫州 325000；3.南昌大學第一附屬醫(yī)院 燒傷科，江西 南昌 330000；4.溫州醫(yī)學院 實驗動物中心，浙江 溫州 325035；5.宜春市人民醫(yī)院 燒傷科，江西 宜春 336000；6.溫州醫(yī)學院 藥學院，浙江 溫州 325035）

骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）具有多分化潛能及一定的免疫抑制作用，是組織工程的主要種子細胞之一[1]。在創(chuàng)傷的微環(huán)境中，MSCs能分泌多種細胞因子促進創(chuàng)傷的愈合及組織生理功能的恢復，是機體創(chuàng)傷修復的重要組織細胞[2-3]。本研究利用一種已經(jīng)制備成功的微孔化脫細胞真皮基質(zhì)（LPADM）[4]，在其上接種MSCs并復合自體刃厚皮移植進行動物在體實驗，觀察了解其對創(chuàng)面修復的效果。

1 材料和方法

1.1 LPADM的制備 取體質(zhì)量約25 kg的健康小白豬，電動取皮刀取刃厚皮0.2 mm，去除表皮及基底膜層，然后在真皮組織上再切取約0.3 mm 斷層真皮片，高滲鹽溶液脫細胞、0.5%戊二醛交聯(lián)Co60照射處理，在懸空的脫細胞真皮基質(zhì)上采用電腦激光模板打孔技術(shù)（選用規(guī)格孔徑：135μm，空間隙：1 mm）均勻貫穿性打孔，制作成LPADM真皮支架備用，詳見文獻[4]。

1.2 MSCs的分離培養(yǎng) 選取4～6周健康雄性SD大鼠[脫臼法處死（動物使用許可證號：SYXK（浙）2010-0150]，無菌條件下取出股骨及脛骨，低糖DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，細胞懸液以1000 r/min離心兩次，每次5 min，棄上清及脂肪層。用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，加入Ficoll細胞分離液的試管中，以2000 r/min離心20 min，吸取單核細胞層，D-hanks液洗滌細胞2次，重懸細胞于含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d換液，棄去未貼壁細胞，保留貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞達到50%融合時，胰蛋白酶消化傳代，參照文獻[5]方法獲得MSCs。

1.3 體外構(gòu)建MSCs-LPADM、MSCs-PADM材料 超凈臺環(huán)境中將LPADM剪成2 cm×2 cm大小，將LPADM表皮面朝上放于6孔板中，加入到含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中浸潤，放入37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中保存4 h。取生長良好的第三代MSCs，胰蛋白酶消化成細胞懸液，調(diào)整密度至4×105個/mL，在6孔板LPADM的表皮面接種1 mL的細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h換液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換液一次，共體外培養(yǎng)5 d。以同樣的操作同期接種一批無孔化真皮基質(zhì)（PADM）。構(gòu)建成MSC-LPADM和MSC-PADM兩種含有MSCs的微孔化和無孔化的真皮基質(zhì)待移植材料。

1.4 動物移植實驗 取健康雄性裸鼠18只，體質(zhì)量約為25 g，隨機分為A（6只）、B（6只）、C（6只）三組。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠（0.01 mL/g），俯臥位固定，同1.1法切取自體刃厚皮，在裸鼠背部正中做一2 cm×2 cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，達深筋膜，將MSCs-LPADM+刃厚皮片組（A組）、LPADM+刃厚皮片組（B組）、MSCs-PADM+刃厚皮片組（C組），移植創(chuàng)基，外用粗網(wǎng)油紗覆蓋打包固定，單籠飼養(yǎng)。于術(shù)后3、7、14 d處死動物整個移植物（含邊緣外0.5 cm）取材。

2 結(jié)果

2.1 真皮基質(zhì)大體觀察 所制備的LPADM呈瓷白色，柔軟、有彈性，貫穿性微孔結(jié)構(gòu)（見圖1）。組織學觀察顯示真皮基質(zhì)脫細胞干凈，未見細胞成分，鏡下示孔徑中膠原排列有序（見圖2-3）。

2.2 復合皮移植的大體觀察 術(shù)后3、7、14 d見A、B兩組皮片泛紅存活；術(shù)后7 d，C組皮片蒼白或發(fā)暗變黑，局部出現(xiàn)干性壞死；術(shù)后14 d，C組皮片完全干性壞死。

2.3 復合皮移植的組織學及透射電鏡觀察組織學觀察，術(shù)后3 d，A、B兩組在移植后真皮基質(zhì)微孔徑結(jié)構(gòu)中均可見空腔樣血管結(jié)構(gòu)形成（見圖4-5），C組真皮基質(zhì)中未見血管結(jié)構(gòu)形成（見圖6）。術(shù)后7 d，A、B兩組真皮基質(zhì)微孔徑結(jié)構(gòu)中血管結(jié)構(gòu)更加明顯，C組中無血管結(jié)構(gòu)形成。術(shù)后14 d，A組真皮基質(zhì)微孔徑結(jié)構(gòu)中可見豐富血管形成，自體刃厚皮與LPADM非孔徑結(jié)構(gòu)處也有較多的毛細血管形成，并可見一些非炎性細胞，可能為MSCs（見圖7-8），B組真皮基質(zhì)微孔徑結(jié)構(gòu)中同樣可見豐富血管形成，真皮基質(zhì)中存在著少量炎性細胞，但復合皮皮片與真皮基質(zhì)交接處所形成的毛細血管較A組少，見炎性細胞聚集（見圖9-10），C組膠原結(jié)構(gòu)中僅見少量細胞遷入，未見血管形成，皮片與真皮基質(zhì)僅見少量細胞結(jié)構(gòu)（見圖11-12）。

圖1 LPADM大體觀

圖2 LPADM橫切面（HE，×400）

圖3 LPADM縱切面（HE，×100）

圖4 A組創(chuàng)面術(shù)后3 d微孔徑結(jié)構(gòu)中可見空腔樣血管結(jié)構(gòu)形成（HE，×200）

圖5 B組創(chuàng)面術(shù)后3 d微孔徑結(jié)構(gòu)中可見空腔樣血管結(jié)構(gòu)形成（HE，×200）

圖6 C組術(shù)后3 d膠原結(jié)構(gòu)中未見血管結(jié)構(gòu)（HE，×200）

圖7 A組術(shù)后14 d微孔徑結(jié)構(gòu)中血管形成，其內(nèi)可見紅細胞（HE，×200）

圖8 A組術(shù)后14 d皮片與真皮基質(zhì)交接處可見一層新生細胞（HE，×200）

圖9 B組術(shù)后14 d微孔徑結(jié)構(gòu)中血管形成，其內(nèi)可見紅細胞（HE，×200）

圖10 B組術(shù)后14 d皮片與真皮基質(zhì)交接處見炎性細胞聚集（HE，×200）

圖11 C組術(shù)后14 d膠原結(jié)構(gòu)中僅見少量細胞遷入，未見血管形成（HE，×200）

圖12 C組術(shù)后14 d皮片與真皮基質(zhì)僅見少量細胞結(jié)構(gòu)（HE，×200）

圖13 A組術(shù)后14 d刃厚皮片與真皮基質(zhì)交接處新生無髓神經(jīng)末梢（TEM，×20000）

透射電鏡顯示A組復合皮的皮片與真皮基質(zhì)交接處有較多的毛細血管形成，并發(fā)現(xiàn)新生的無髓神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)。在真皮基質(zhì)的淺層，可見單個皮脂腺樣細胞，深層見單個汗腺樣細胞，但未見到毛囊細胞（見圖13-14）。B組復合皮皮片與真皮基質(zhì)交接處所形成的毛細血管較A組少，可見中性粒細胞遷入。B、C組均未見神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)及單一腺細胞。

圖14 A組術(shù)后14 d微孔化真皮基質(zhì)淺層出現(xiàn)單個類似皮脂腺細胞（TEM，×6000）

3 討論

復合皮移植及其生理功能的重建，一直是皮膚深度損傷（如燒傷、創(chuàng)傷、慢性潰瘍等造成）創(chuàng)面治療的重要課題[6-8]。臨床上深度燒傷患者行脫細胞真皮基質(zhì)復合自體皮移植后，短期內(nèi)往往不能實現(xiàn)移植皮片與真皮基質(zhì)的緊密結(jié)合，創(chuàng)面愈合后更是缺乏毛囊、汗腺等皮膚附屬器官，導致復合皮的生理功能得不到有效地重建[3，8-9]。之前我們已制備了一種LPADM，實驗證實這種真皮基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)較快速的血管化，實現(xiàn)移植皮片與真皮基質(zhì)的緊密結(jié)合[4]。本研究即在此基礎(chǔ)上，接種MSCs于LPADM，并通過動物移植觀察在體微環(huán)境中MSCs的可能作用，從而為重建皮膚生理功能提供可能。

LPADM中孔徑結(jié)構(gòu)的存在，可能使得移植的早期MSCs成活并行使功能。Inoue等[10]在糖尿病大鼠的全層皮膚缺損模型上移植接種有MSCs的人工真皮，發(fā)現(xiàn)MSCs在創(chuàng)傷愈合過程中會停留在皮膚受損部位，并可通過促進移植物的血管化程度來加速皮膚創(chuàng)傷的愈合。本研究中，接種有MSCs的LPADM和沒有接種MSCs的LPADM，在體移植后均實現(xiàn)了良好的血管化，這與LPADM材料本身具有較快速實現(xiàn)血管化能力有關(guān)[4]。而在微孔結(jié)構(gòu)以外的膠原中，接種有MSCs的LPADM可見毛細血管的形成，提示接種的MSCs對真皮基質(zhì)的血管化具有一定的促進作用。另外研究中電鏡發(fā)現(xiàn)MSCs-LPADM+刃厚皮片組移植的刃厚皮片下有更多的毛細血管形成，也進一步證實MSCs的促血管化作用。

MSCs接種成活后，能夠在創(chuàng)面的微環(huán)境中分泌多種促進創(chuàng)傷修復的細胞因子，這些細胞因子作用于復合皮，促進了復合皮血管、神經(jīng)的再生[3，11]。本研究中電鏡顯示在MSCs-LPADM+刃厚皮片組復合移植的真皮基質(zhì)中，炎癥細胞的數(shù)量即明顯少于LPADM+刃厚皮片組。MSCs-LPADM+刃厚皮片組復合移植術(shù)后14 d，在真皮基質(zhì)的淺層，除了可以看到新遷入的成纖維細胞和少量的炎癥細胞之外，更發(fā)現(xiàn)皮脂腺樣細胞，無髓鞘神經(jīng)樣末梢結(jié)構(gòu)，深層則見到汗腺樣細胞，但沒有看到毛囊樣結(jié)構(gòu)。這究竟是外源性添加的MSCs多向分化的結(jié)果，還是自身刃厚皮片殘留的皮膚附件多種細胞增生，向下遷移的結(jié)果呢？如果是刃厚皮片自身殘留的皮膚附件結(jié)構(gòu)或者自身殘留附件增生，電鏡下應(yīng)為成熟的具有功能的結(jié)構(gòu)，而不應(yīng)是目前我們實驗中看到的這些單一類汗腺樣細胞、單一類皮脂腺樣細胞及無髓樣神經(jīng)樣結(jié)構(gòu)，因此，它們來源于外源性MSCs的可能性更大，即可能是由刃厚皮片中殘留的皮膚附件誘導外源性MSCs在體內(nèi)微孔化LPADM微環(huán)境下增殖、分化的結(jié)果。

總之，我們認為，LPADM復合移植給提前種植的外源性MSCs提供較為理想的增殖分化微環(huán)境。對重建移植后皮膚功能提供了一種方法或思路。

[1] Sorrell JM, Caplan AI. Topical delivery of mesenchymal stem cells and their function in wounds[J]. Stem Cell Res Ther, 2010, 1(4):30.

[2] Karp JM, Teo GSL. Mesenchymal stem cell homing:the devil is in the details[J]. Cell Stem Cell, 2009, 4(3):206-216.

[3] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science,1999, 284(5411):143-147.

[4] 林才, 羅旭, 王平, 等. 激光微孔豬脫細胞真皮基質(zhì)的制備及生物相容性評價[J]. 中華燒傷雜志, 2011, 27(6):463-465.

[5] 陳凱, 康現(xiàn)江, 張平, 等. SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)及表型、純度鑒定[J]. 山東醫(yī)藥, 2010, 50(l1):34-36.

[6] Navsaria HA, Ojeh NO, Moiemen N, et al. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template(Integra)[J]. Plast Reconstr Surg, 2004, 113(3):978-981.

[7] Moiemen NS, Staiano JJ, Ojeh NO, et al. Reconstructive surgery with a dermal regeneration template:clinical and histologic study[J]. Plast Reconstr Surg, 2001, 108(1):93-103.

[8] Heimbach D, Luterman A, Burke J, et al. Artificial dermis for major burns. A multi-center randomized clinical trial[J].Ann Surg, 1988, 208(3):313-320.

[9] Pellegrini G, Ranno R, Stracuzzi G, et al. The control of epidermal stem cells (holoclones) in the treatment of massive full-thickness burns with autologous keratinocytes cultured on fibrin[J]. Transplantation, 1999, 68(6):868-879.

[10]Inoue H, Murakami T, Ajiki T, et al. Bioimaging assessment and effect of skin wound healing using bone-marrow-derived mesenchymal stromal cells with the artificial dermis in diabetic rats[J]. J Biomed Opt, 2008, 13(6):064036.

[11]Hamou C, Callaghan MJ, Thangarajah H, et al. Mesenchymal stem cells can participate in ischemic neovascularization[J]. Plast Reconstr Surg, 2009, 123(2Suppl):45S-55S.