王芳，賈萬(wàn)利，李會(huì)珍

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051）

轉(zhuǎn)谷酰胺酶（Transglutaminase，TG）存在于動(dòng)物、植物和微生物中，不同來(lái)源的酶都各有自己的性質(zhì)，目前研究和應(yīng)用最多的酶是來(lái)源于微生物輪枝鏈霉菌（Streptoverticillum mobaraense）的酶，這是目前唯一商業(yè)化的轉(zhuǎn)谷酰胺酶。微生物轉(zhuǎn)谷酰胺酶（MTG）是一種不依賴(lài)鈣的酶，此外，它對(duì)氨基酸殘基的專(zhuān)一性要求也比較低。因此與其他來(lái)源的轉(zhuǎn)谷酰胺酶相比，MTG 酶能與更多蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，而且MTG 酶形成的質(zhì)構(gòu)特性更優(yōu)。MTG 酶能夠催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基與賴(lài)氨酸之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通過(guò)胺的導(dǎo)入、交聯(lián)形成共價(jià)鍵，從而形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可在一定程度上改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性。近年來(lái)，有研究報(bào)道外源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能催化食品蛋白質(zhì)交聯(lián)或谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶介導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚合作用，從而改善相應(yīng)蛋白質(zhì)功能特性。研究的蛋白質(zhì)種類(lèi)包括牛奶酪蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白、豬肉肉糜、牛肉肉糜等，研究?jī)?nèi)容包括酶對(duì)食品基質(zhì)的作用效果，以及酶對(duì)蛋白質(zhì)底物的催化特性及機(jī)理[1-6]。

豬肉是我國(guó)居民消費(fèi)量最多的一類(lèi)肉，豬血產(chǎn)量可達(dá)到10.5 億kg[7]。豬血中含有至少100 種不同的蛋白質(zhì)組分，其中血漿白蛋白占60%，血漿球蛋白占35%，血纖維蛋白占4%，很多都可以作為食品的功能性組分[8-9]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)豬血的綜合利用，主要有制作飼用血粉、提取生化藥品，如血紅素、超氧化物歧化酶、蛋白胨等，此外還有很大一部分用于提取血漿蛋白并應(yīng)用在食品中。工業(yè)化屠宰得到的血漿可用于肉品加工，如豬血漿還可以作為脂肪替代品應(yīng)用在低脂肉制品中[10]。豬血在香腸中的應(yīng)用則更為普遍[11]，其中血漿的作用是在熱誘導(dǎo)條件下形成凝膠，增強(qiáng)香腸的質(zhì)構(gòu)特性[12]。

豬血形成熱凝膠的能力和其乳化特性對(duì)食品加工是非常重要的[13]。能形成熱誘導(dǎo)凝膠的主要是血漿白蛋白，鈣以及凝血相關(guān)的酶能增強(qiáng)凝膠活性。有研究報(bào)道了豬血漿蛋白熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性及持水性因素的研究，認(rèn)為血漿蛋白濃度、加熱時(shí)間、離子種類(lèi)和pH 都對(duì)凝膠特性有影響[14]。對(duì)豬血漿蛋白凝膠性質(zhì)的系統(tǒng)研究有利于其在食品中的應(yīng)用[15]。本試驗(yàn)主要探討微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的添加及作用條件對(duì)豬血漿蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性及持水性的影響，以期找到MTG 酶對(duì)豬血凝膠的作用規(guī)律，找到最佳的酶處理方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG 酶）：酶活性為100 U/g，日本味之素株式會(huì)社；檸檬酸三鈉（分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XPLUS 質(zhì)構(gòu)儀：英國(guó)Stable Micro System 公司；SD-1000 Spray Dryer：日本東京理化株式會(huì)社；ALC-210 型萬(wàn)分之一電子天平：Acculab 公司；TDL-5C低速臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；S20P SevenEasyTMPlus pH 酸度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 豬血漿蛋白粉的制備

收集新鮮豬血，添加8 g/100 mL 檸檬酸三鈉以防止凝血，在4 ℃以1 388 g 離心10 min，得到豬血漿蛋白。豬血漿蛋白以進(jìn)風(fēng)溫度240 ℃，出風(fēng)溫度85 ℃進(jìn)行噴霧干燥制得豬血漿蛋白粉。其水分含量為7.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蛋白質(zhì)含量為82%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.3.2 添加MTG 酶的豬血漿蛋白凝膠制備

表1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在豬血漿蛋白凝膠中的添加方式Table 1 Levels of transglutaminase addition in porcine blood plasma gel

1.3.3 豬血漿蛋白凝膠失水率測(cè)定

失水率測(cè)定前樣品提前從4 ℃冰箱中取出，于室溫放置30 min。凝膠柱（長(zhǎng)14 mm，直徑8 mm）置于離心管（0.45 μm）中，以4 000 g 離心10 min，測(cè)定樣品損失的重量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。失水率計(jì)算公式如下：

式中：M1為離心前凝膠柱質(zhì)量；M2為離心后凝膠柱質(zhì)量。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

質(zhì)構(gòu)測(cè)定前樣品提前從4 ℃冰箱中取出，于室溫放置30 min。樣品為直徑8 mm，長(zhǎng)14 mm 的圓柱，應(yīng)用TPA 程序測(cè)定硬度、彈性和內(nèi)聚性。樣品用鋁圓柱探頭（直徑50 mm）下壓兩次，高度為初始高度的25%，前速度為60 mm/min，下壓至30 %變形，下壓速度為1 mm/s，回復(fù)時(shí)間為2 s，硬度、彈性、內(nèi)聚性值由TPA曲線(xiàn)計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)3 次取平均結(jié)果。數(shù)據(jù)結(jié)果采用最短顯著極差法（SSR 法）進(jìn)行多重比較[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTG 酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠失水率的影響

MTG 酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠失水率的影響見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，與未添加MTG 酶的豬血漿蛋白凝膠失水率相比，MTG 酶處理組凝膠的失水率顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明MTG 酶的添加顯著提高了豬血蛋白凝膠的持水性。但是從酶濃度和保溫時(shí)間組合的6 個(gè)試驗(yàn)組的結(jié)果來(lái)看，酶濃度和保溫時(shí)間對(duì)凝膠失水率的影響是相互依賴(lài)的，不存在單向促進(jìn)或減少的作用趨勢(shì)。在保溫時(shí)間為30 min 的4 組處理中，隨著酶添加量增大，凝膠失水率減小，表明酶量的增加提高了凝膠的持水性。而在保溫60 min 的4 組處理中，酶量在0.6 g/100 mL 時(shí)凝膠的持水量達(dá)到最高，酶量的繼續(xù)增加對(duì)持水性沒(méi)有進(jìn)一步的增強(qiáng)作用，反而有所降低。

圖1 MTG 酶添加量對(duì)豬血蛋白凝膠失水率的影響Fig.1 Effect of MTGase on water released of porcine plasma protein gels

如果MTG 酶添加量固定，在0～0.6 g/100 mL 的范圍內(nèi)，40 ℃保溫時(shí)間越長(zhǎng)，則凝膠失水率越小。血漿蛋白是賴(lài)氨酸的極好來(lái)源，酶處理可以使蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，以及小肽分子間的交聯(lián)，形成堅(jiān)試的空間結(jié)構(gòu)，將水分子包容其中，從而減小豬血凝膠的失水率。然而，交聯(lián)率同時(shí)取決于賴(lài)氨酸和谷氨酸殘基的接觸概率。豬血漿蛋白中的蛋白質(zhì)天然狀態(tài)多為球蛋白，由于其天然狀態(tài)下緊密的結(jié)構(gòu)，MTG 酶不容易接近目標(biāo)殘基，因而不容易催化發(fā)生交聯(lián)。因此在酶處理過(guò)程中保溫適當(dāng)?shù)臅r(shí)間非常重要，因?yàn)镸TG 酶在催化蛋白質(zhì)時(shí)，存在一個(gè)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的過(guò)程，此時(shí)，較緊密的蛋白質(zhì)球狀空間結(jié)構(gòu)逐步展開(kāi)，暴露出內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基，二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變[2]。蛋白質(zhì)受酶的誘導(dǎo)及加熱變性部分展開(kāi)結(jié)構(gòu)后，則可以暴露更多的作用位點(diǎn)，增加酶的敏感性，更易于發(fā)生聚合反應(yīng)。然而，保溫時(shí)間對(duì)于酶敏感性的影響并不是越長(zhǎng)越好，增加酶添加量可以縮短保溫時(shí)間，反之亦然。在試驗(yàn)條件下，酶添加量為0.6 g/100 mL 時(shí)40 ℃保溫60 min 豬血凝膠持水率最大，添加量0.9 g/100 mL時(shí)40 ℃保溫30 min 也可以達(dá)到相似的效果。以上結(jié)果說(shuō)明保溫時(shí)間和酶添加量對(duì)持水性有協(xié)同作用，在試踐中可以根據(jù)試際需要調(diào)整酶用量和作用時(shí)間?？偟膩?lái)講，MTG 酶的添加，增強(qiáng)了豬血漿蛋白凝膠中蛋白質(zhì)—水分的相互作用力，從而減少了失水率。這一特征在肉品加工中可以增加產(chǎn)品得率，對(duì)肉品加工企業(yè)有試際意義。

2.2 MTG 酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠硬度的影響

MTG 酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠硬度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 MTG 酶添加量對(duì)豬血蛋白凝膠硬度的影響Fig.2 Effect of MTGase on hardness of porcine plasma protein gels

圖2 表明，添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶后，血漿蛋白凝膠的硬度增大。統(tǒng)計(jì)分析表明，酶處理的豬血凝膠樣品總體上比對(duì)照組硬度顯著增加（P＜0.05）。酶添加量在0.6 g/100 mL 并且40 ℃保溫60 min 時(shí)凝膠硬度達(dá)到最大。這可能是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的作用促進(jìn)了蛋白分子之間的作用力，增加了凝膠硬度，然而添加酶的不同處理組之間硬度差異不顯著。值得注意的是，不添加MTG 酶單純加熱也可以提高豬血蛋白凝膠的硬度，血漿組分非常復(fù)雜，含有多種酶，熱處理可能涉及到蛋白質(zhì)變性、聚集和凝膠的綜合反應(yīng)，從而使凝膠硬度增加。此外，保溫時(shí)間也顯著影響凝膠硬度（P＜0.05），當(dāng)保溫時(shí)間為60 min 時(shí)，豬血蛋白凝膠硬度普遍高于保溫30 min 組的硬度值。在本試驗(yàn)中盡管沒(méi)有考慮更高的保溫時(shí)間，試驗(yàn)室進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)包括保溫時(shí)間到120 min 表明，在同一個(gè)酶濃度水平，保溫60 min 就能達(dá)到最大硬度值，超過(guò)60 min 硬度沒(méi)有繼續(xù)增加。如果保溫時(shí)間一定，則在0～0.6 g/100 mL 的范圍內(nèi)，隨著酶濃度的增加，凝膠硬度增加。超過(guò)0.6 g/100 mL，酶濃度的增加硬度反而有所下降。這說(shuō)明MTG 酶添加量與保溫時(shí)間存在最佳組合，超過(guò)酶的最佳處理?xiàng)l件范圍，凝膠質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生副作用。其原因可能是過(guò)量的交聯(lián)共價(jià)鍵將會(huì)抑制蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)均一性的發(fā)展。

0.6g/100 mL 的酶濃度相當(dāng)于4 U/g 豬血蛋白，與文獻(xiàn)中報(bào)道的值比較一致。文獻(xiàn)報(bào)道在牛肉凝膠中用到的MTG 酶濃度是1.4 U/g 牛肉蛋白[17]，3 U/g～6 U/g豬肉蛋白凝膠[18]，10 U/g 燕麥球蛋白[19]。用于交聯(lián)牛乳蛋白的量是20 U/g 牛乳蛋白[20]。

2.3 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量對(duì)豬血凝膠彈性和內(nèi)聚性的影響

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠彈性和內(nèi)聚性的影響見(jiàn)表2。

表2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量對(duì)豬血漿蛋白凝膠彈性和內(nèi)聚性的影響Table 2 Effect of transglutaminase on springiness and cohesiveness of porcine blood plasma gelling

從表2 可以看出，添加MTG 酶能增加豬血凝膠的彈性，與不添加酶的對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），而酶的添加對(duì)豬血凝膠的內(nèi)聚性沒(méi)有顯著影響。在質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL～0.9 g/100 mL 的范圍內(nèi)，不同的酶濃度對(duì)豬血凝膠彈性的影響差異不大。與對(duì)照組相比，不添加MTG 酶只進(jìn)行40 ℃保溫的處理對(duì)豬血凝膠的彈性也有顯著影響（P＜0.05），說(shuō)明加熱可以提高凝膠的彈性，但是40 ℃保溫60 min 的時(shí)間段內(nèi)，不同的保溫時(shí)間對(duì)凝膠彈性沒(méi)有差異。

MTG 酶對(duì)豬血漿蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響效果有其微觀結(jié)構(gòu)解釋?zhuān)称返鞍踪|(zhì)的質(zhì)構(gòu)特征比如硬度、內(nèi)聚力、彈性都可能通過(guò)改變自然交聯(lián)或者在蛋白結(jié)構(gòu)中引入新的交聯(lián)來(lái)試現(xiàn)，因此MTG 酶的添加能夠起到蛋白質(zhì)交聯(lián)的作用，從而改善凝膠質(zhì)構(gòu).從目前結(jié)果來(lái)看，添加MTG 酶和加熱兩個(gè)條件都對(duì)凝膠的彈性產(chǎn)生影響，但對(duì)內(nèi)聚性不產(chǎn)生顯著影響。對(duì)于凝膠內(nèi)聚性的要求需要提供另外的條件進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

可以得出結(jié)論，血漿蛋白的凝膠特性可以通過(guò)添加MTG 酶并保溫來(lái)改善，尤其是能夠減少凝膠失水率。最佳處理?xiàng)l件是添加0.6 g/100 mL 濃度的MTG 酶與豬血漿蛋白溶液在pH 7 時(shí)40 ℃保溫60 min。在這一條件下，酶處理使凝膠硬度顯著增加，并降低凝膠的失水率約3%。值得注意的是，單獨(dú)熱處理也能增加凝膠硬度，而MTG 酶的添加和熱處理有協(xié)同作用。此外，MTG 酶的添加能顯著提高凝膠彈性，但是對(duì)凝膠內(nèi)聚性沒(méi)有顯著影響?？偟膩?lái)說(shuō)，以上結(jié)果表明豬血蛋白凝膠中添加MTG 酶并保溫一段時(shí)間能促進(jìn)血漿凝膠特性。應(yīng)該還有許多其他方法來(lái)促進(jìn)血漿凝膠的特性，如可以結(jié)合MTG 酶和還原試劑一起發(fā)揮作用，或者通過(guò)血漿超濾作用增加亞基濃度，然后再進(jìn)行酶處理，有待于進(jìn)一步研究。

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