李蓮年，董秀濤，王麗麗，張春曉

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018)

畢赤酵母是單細胞真核微生物，在營養(yǎng)豐富的條件下，能夠以單倍體或二倍體出芽的方式進行無性生殖，在營養(yǎng)貧瘠時，二倍體能夠以有性生殖方式進行減數(shù)分裂，產(chǎn)生單倍體的子囊孢子［1］。盡管畢赤酵母已經(jīng)成為生產(chǎn)外源蛋白特別是真核生物蛋白的理想宿主［2］，然而酵母的經(jīng)典遺傳育種仍然起著極其關(guān)鍵的作用，如基因突變、回交以去除次級突變，基因功能的互補分析等，因此畢赤酵母單倍體的制備尤顯重要。本文以畢赤酵母Pichia pastorisX33為研究材料，探討影響子囊孢子形成的因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X-33，購于invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 按以下配方配制，分別于121℃下滅菌20 min。①YPD固體培養(yǎng)基:蛋白胨2%，酵母粉1%，瓊脂2%，葡萄糖2%，滅菌后倒平板備用;②乙酸鈉誘導生孢培養(yǎng)基［3］:無水乙酸鈉0.82%，氯化鉀0.186%，復合微量元素溶液母液0.1 mL/100 mL，瓊脂2 g/100 mL，pH值自然。微量元素復合液的組成:Na2B4O7·10H2O 0.8 mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.9 mg ，KI 10 mg，F(xiàn)e2(SO4)3·6H2O 22.8 mg，MnCl2·4H2O 3.6 mg，ZnSO4·7H2O 30.8 mg，CuSO4·H2O 3.9 mg，蒸餾水100 mL，加入1 mol/L HCl使之不再渾濁為止;③SM培養(yǎng)基［4］:NaAc 0.5%，KCl 1%，葡萄糖1%，瓊脂2%，pH值自然;④其他生孢培養(yǎng)基(A-O):分別配制葡萄糖25%，KCl 15%，NaAc 25%，KAc 25%，NaCl 15%，瓊脂4%，復合微量元素母液，自來水。分別滅菌，根據(jù)實驗需求配制所需離子濃度的生孢固體培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)基成分見表1。

表1 誘導生孢培養(yǎng)基成分表Table1 The sporulation media

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母的活化 將畢赤酵母菌種劃線于YPD培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)72 h后，再于YPD平板上連續(xù)傳代1次或2次，第3代畢赤酵母的平板培養(yǎng)48 h備用。

1.2.2 子囊孢子誘導溫度的確定 將菌涂布于乙酸鈉誘導生孢培養(yǎng)基上，分別于25、28、30℃進行誘導培養(yǎng)，確定最適生孢溫度。

1.2.3 子囊孢子的誘導 將上述平板上的菌苔分別涂布在不同的誘導培養(yǎng)基平板(表1)上進行培養(yǎng)，從48 h開始每24 h取1次樣觀察子囊孢子誘導情況。

1.2.4 子囊孢子的觀察 采用單染色方法［5］，菌體涂片，熱固定，用2%堿性復紅染色1 min，流水淋洗30 s，鏡檢制片，營養(yǎng)體為紅色，子囊孢子為無色。分別選取4個視野記錄子囊在視野中的百分比數(shù)，求其平均數(shù)確定為畢赤酵母生孢率。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母的預培養(yǎng)時間對生孢的影響

在對畢赤酵母的活化培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，菌株的生長周期與傳代次數(shù)有著密切的關(guān)系，從初期的活化到傳代3次，菌株的生長周期是隨著傳代次數(shù)增多而變短，且在第3代時菌活力最好，最利于進行生孢培養(yǎng)。徐志彥［6］指出，孢子形成一般起源于富氮培養(yǎng)基(或稱預培養(yǎng)基)上生長的細胞轉(zhuǎn)入乙酸鉀培養(yǎng)基，預培養(yǎng)基的營養(yǎng)越豐富，孢子形成的比例越高。故實驗中選用了營養(yǎng)豐富的YPD培養(yǎng)基對畢赤酵母進行活化和預培養(yǎng)。實驗結(jié)果證明經(jīng)過3次傳代的酵母生孢要比經(jīng)過一次活化的酵母生孢率提高0.4倍左右(如圖1所示)。

圖1 P.pastoris X33不同活化次數(shù)對生孢的影響Fig.1 The sporulation of P.pastoris X33 by different times rejuvenation

2.2 溫度對畢赤酵母生孢的影響

曾洪梅［7］曾經(jīng)對面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株X-8進行生孢的最適溫度篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株X-8在28℃時生孢最好，當溫度小于20℃或大于32℃其生孢能力均明顯下降，37℃時面包酵母完全不生孢。李華等［8］也對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最適生孢溫度進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在25～28℃時酵母生孢效果好。這些研究結(jié)果均表明溫度對面包酵母(即釀酒酵母)生孢有著很大的影響?；谝陨涎芯繉叧嘟湍干哒T導溫度篩選確定在25、28、30℃3個溫度梯度上培養(yǎng)。

將同一平板上酵母菌分別均勻涂布于3個乙酸鈉誘導生孢培養(yǎng)基上，分別放于25、28、30℃進行誘導培養(yǎng)，72 h后進行鏡檢觀察。結(jié)果表明，在28℃時畢赤酵母的生孢量最高，其次是25℃的菌，生孢量最少的是30℃培養(yǎng)箱里誘導生孢的酵母。分析原因可能是畢赤酵母在略低于自己最適生長溫度的環(huán)境里更適宜生孢，但是當溫度過低時又會影響菌的生長，從而導致畢赤酵母生孢率的下降。因此，在后續(xù)的實驗中將培養(yǎng)溫度定在28℃，然后又對其他因子對畢赤酵母生孢的影響做了進一步的研究。

2.3 K+、Na+、Cl－、Ac－等離子對畢赤酵母生孢的影響

Cregg J M等［4］是利用SM培養(yǎng)基對畢赤酵母進行誘導生孢的，本研究也做了同樣的誘導，發(fā)現(xiàn)生孢率不到40%。同樣本研究也將畢赤酵母放在適合于釀酒酵母的乙酸鈉誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，生孢率也不到20%。因此，將這2種生孢培養(yǎng)基的成分進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了碳源多加了1%的葡萄糖外，KCl成分的含量相差近5倍，故對KCl在畢赤酵母生孢上的影響做重點分析。

在其他成分不變的情況下改變KCl的濃度，見表1中A、B、C、D 4種培養(yǎng)基(KCl的濃度分別為0%、0.6%、1.2%、1.8%)，將活化好的菌均勻涂布于這4個平板上，放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從48 h開始每24 h取1次樣進行鏡檢觀察，結(jié)果顯示(圖2):KCl濃度為0.186%時(即乙酸鈉誘導培養(yǎng)基)7 d生孢率不到20%;當KCl濃度為0.6%時畢赤酵母X-33的7 d生孢率達到最高為72%(B培養(yǎng)基);KCl濃度為1.2%(C培養(yǎng)基)生孢率明顯開始下降，7 d僅為52%;而當KCl缺乏時畢赤酵母完全不生孢(A培養(yǎng)基)，這說明KCl是影響畢赤酵母生孢的關(guān)鍵因子，但高濃度的KCl反而在一定程度上抑制生孢，因此K+可能調(diào)控與生孢有關(guān)蛋白的表達及其活性。

圖2 KCl濃度對畢赤酵母生孢率的影響Fig.2 The Pichia sporulation efficiency influenced by KCl concentration

為進一步分析到底是K+、Cl－還是2種離子同時存在對畢赤酵母生孢產(chǎn)生誘導作用，配制L、M和O培養(yǎng)基進行更深入的分析。各培養(yǎng)基7 d誘導生孢率結(jié)果見圖3，通過比較B和L培養(yǎng)基對畢赤酵母生孢誘導的結(jié)果，表明在2種培養(yǎng)基中Cl－同時存在時，只有Na+和K+的差別，當無K+而Na+存在(L培養(yǎng)基)，不能誘導生孢，說明誘導生孢的關(guān)鍵因子不是Na+和Cl－，而是K+。

圖3 K+、Na+等對畢赤酵母生孢率的影響Fig.3 The Pichia sporulation efficiency influenced by K+、Na+

A和M培養(yǎng)基同時存在Ac－，在無Cl－的情況下，A培養(yǎng)基上不生孢，M培養(yǎng)基上7 d生孢率能達到50%，表明Ac－并不是誘導畢赤酵母生孢的決定性因素。比較E培養(yǎng)基與M培養(yǎng)基，兩者都含有K+，只有Ac－和Cl－的差別，其中僅含有Ac－的M培養(yǎng)基7 d生孢率為50%，而僅含有Cl－的E培養(yǎng)基其7 d生孢率僅為0.6%，可見Ac－在誘導畢赤酵母生孢過程中起到了促進作用。O培養(yǎng)基中只含有Na+和Cl－，畢赤酵母不能生孢從而進一步證明了Na+和Cl－對畢赤酵母生孢的影響不大。

2.4 碳源對畢赤酵母生孢的影響

酵母在部分缺乏碳源的培養(yǎng)基上孢子形成良好，但在碳源供應嚴重缺乏，酵母處于饑餓狀態(tài)時就不能形成孢子，或極少形成孢子［9］。由此，在基于釀酒酵母中條件已經(jīng)成熟的乙酸鈉誘導生孢培養(yǎng)基上改變其碳源成分與含量來探討誘導畢赤酵母生孢的最適碳源。

實驗中先在以乙酸鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖，結(jié)果如圖4所示。加入葡萄糖后生孢量明顯增加，是未加葡萄糖培養(yǎng)基的10倍左右。然后在加了1%葡萄糖基礎(chǔ)上改變乙酸鈉的濃度來確定誘導畢赤酵母生孢的最適乙酸鈉濃度，具體成分見表1中的E、F、B、G、H這5組培養(yǎng)基。結(jié)果見圖5，當培養(yǎng)基中不含乙酸鈉時畢赤酵母只有個別生孢(E培養(yǎng)基)，而當乙酸鈉含量大于2%時，生孢率也隨著乙酸鈉的濃度增大而降低(培養(yǎng)基G、H)，只有當乙酸鈉含量在1%左右時畢赤酵母的生孢率最高為72%左右(B培養(yǎng)基)。

圖4 乙酸鈉培養(yǎng)基中葡萄糖對畢赤酵母生孢率的影響Fig.4 The Pichia sporulation efficiency influenced by glucose in sodium acetate medium

以上結(jié)果表明，畢赤酵母產(chǎn)生子囊孢子時需要一定的碳源來支撐自身基本的生長和營養(yǎng)需求，少量的葡萄糖可以給酵母提供能量促進子囊孢子生成。而乙酸鈉則是作為一種誘導碳源來促進酵母大量產(chǎn)孢，缺少乙酸鈉時產(chǎn)孢率極低，當其含量過大時又會影響子囊孢子的形成。

圖5 乙酸鈉的濃度對畢赤酵母生孢率的影響Fig.5 The Pichia sporulation efficiency influenced by sodium acetate

2.5 微量元素的影響

圖6 微量元素對生孢率的影響Fig.6 The Pichia sporulation efficiency influenced by trace elements

關(guān)于乙酸鈉培養(yǎng)基中微量元素的影響，王麗麗等［3］通過加大微量元素的量得出當其含量為0.1 mL/100 mL時誘導酵母生孢的效果很好，但如果不加微量元素生孢率將如何變化，因此本研究做了1組不加微量元素的培養(yǎng)基J，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不加微量元素時生孢速度不如加微量元素的誘導培養(yǎng)基，但6 d后的生孢率基本趨于一致(圖5)。由此可知微量元素的加入可以加快畢赤酵母的生孢速度，但對其長時間生孢的最終生孢率影響不大。

3 討論

目前已有大量的文獻［10-12］對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等子囊孢子產(chǎn)生的條件進行了研究，本文基于釀酒酵母產(chǎn)孢應用條件成熟的乙酸鈉誘導培養(yǎng)基來分析影響畢赤酵母生孢的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與釀酒酵母產(chǎn)生子囊孢子的許多影響因素基本相似，在生孢培養(yǎng)基的成分含量上稍微有些差異，總結(jié)目前畢赤酵母的最適生孢程序及條件:用含有酵母粉的豐富培養(yǎng)基如YPD培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)，連續(xù)2次傳代后將菌涂布于乙酸鈉1%，氯化鉀0.6%，葡萄糖1%，微量元素0.1%，瓊脂2%的誘導培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h子囊孢子就開始生成，7 d最高生孢率為72%左右。這個生孢率相對于釀酒酵母研究的生孢率［10-12］要低，這可能是因菌種的差別所致，適合于釀酒酵母的生孢培養(yǎng)基并不一定適用于其他的酵母菌種。

在對畢赤酵母子囊孢子生成條件的分析中發(fā)現(xiàn)，只添加乙酸鈉和葡萄糖等碳源的培養(yǎng)基上畢赤酵母不生孢，而在以葡萄糖為碳源加有氯化鉀的培養(yǎng)基上畢赤酵母只是極其少量的生孢，而只有在鉀離子和乙酸根離子同時存在時生孢量才會大幅度增加，從結(jié)果分析來看，其生孢率最高能達72%，其中鉀離子和乙酸根離子對畢赤酵母子囊孢子的誘導產(chǎn)生有明顯的促進作用。這可能是由于鉀離子的誘導作用或是它參與某些蛋白質(zhì)的合成調(diào)控或其酶活性，具體原因目前還不太清楚，有待于進一步研究。

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