桓明輝，關(guān)艷麗，陳 飛

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽 122000)

DH5α是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?。E.coli DH5α在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α-互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室頻繁使用的一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。對(duì)細(xì)菌而言，為達(dá)到高效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108細(xì)胞/mL。對(duì)于大多數(shù)E.coli來說，相當(dāng)于 OD600為 0.4 左右，但由于轉(zhuǎn)化是一個(gè)很復(fù)雜的過程，具體的作用機(jī)理仍在探究中。有文獻(xiàn)指出［1］，細(xì)菌的最佳感受態(tài)細(xì)胞制備期對(duì)于不同菌株是不同的，并不一定都是在活細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/mL的時(shí)候最適宜，有必要針對(duì)所使用的菌株確定其最佳轉(zhuǎn)化條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 E.coli DH5α，pUC18質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 X-gal，IPTG，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素溶液，0.1 mol/L CaCl2溶液，均按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的要求配制。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生長情況的測(cè)定［2-3］從平板上挑取單個(gè)菌落(直徑2～3 mm)到含有30 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃下250 r/min培養(yǎng)過夜。取出0.3 mL培養(yǎng)物到含有15 mL LB培養(yǎng)基試管中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔20 min取出1支試管，放于冰箱。統(tǒng)一測(cè)定菌液的OD600，繪制生長曲線。選取幾個(gè)不同時(shí)相的菌液倍比稀釋從10－1～10－6，各取0.1 mL稀釋液涂布 LB 平板培養(yǎng)基，37℃正向培養(yǎng)1 h后，倒置培養(yǎng)12～16 h。每個(gè)稀釋度鋪3個(gè)平板，計(jì)數(shù)，作OD600-活菌細(xì)胞濃度圖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備［4］利用裂解法抽提pUC18質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外分析儀下觀察，將顯示為超螺旋DNA帶型的凝膠切下，利用透析袋法進(jìn)行回收后，電泳確保質(zhì)粒全部為超螺旋狀態(tài)，測(cè)定其濃度及純度，IE緩沖液稀釋為0.05 μg/mL，保存于 －20 ℃。

1.2.3 大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化［5-7］37℃下250 r/min培養(yǎng)過夜的大腸埃希菌培養(yǎng)物，按1∶40接種于15 mL LB培養(yǎng)基的試管中，繼續(xù)振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)。根據(jù)生長曲線，每隔一定時(shí)間取1支菌液，測(cè)定OD600后，1.5 mL轉(zhuǎn)入10 mL無菌離心管，冰浴中冷卻10 min，4℃，4 000 r/min離心10 min，棄上清，用1/2體積的預(yù)冷0.1 mol/L CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，冰浴中放置30 min，4℃，4 000 r/min離心10 min。根據(jù)OD600-活菌細(xì)胞濃度圖，加入一定體積的0.1 mol/L CaCl2溶液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×109細(xì)胞/mL，取200 μL感受態(tài)細(xì)胞，分裝到1.5 mL無菌離心管，4℃保存過夜。加入0.1 g質(zhì)粒DNA，冰浴30 min后42℃熱休克60～90 s，冰浴中迅速冷卻2～3 min，加入0.8 mL LB培養(yǎng)基，37℃低速振蕩培養(yǎng)1 h，室溫，4 000 r/min 離心5 min，吸去0.9 mL 培養(yǎng)基，混勻剩余培養(yǎng)物，全部涂布在加有X-gal，IPTG及氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，37℃正向培養(yǎng)1 h后，倒置培養(yǎng)12～16 h，每個(gè)時(shí)相涂布9個(gè)平板，并以未加質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化液作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.coil DH5α的生長曲線

在菌株與菌株之間，OD值與每毫升中活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過測(cè)定特定E.coli的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時(shí)相的OD600，從0～10 h，測(cè)定細(xì)菌不同生長時(shí)期的OD600，繪制生長曲線。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長密度不至過高，應(yīng)每隔15～20 min檢測(cè)OD600(表1)。得到E.coli DH5α的生長曲線(見圖1)，以便預(yù)測(cè)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.4的培養(yǎng)時(shí)間。如圖1所示，該生長曲線主要包括了E.coli DH5α在37℃培養(yǎng)條件下群體生長周期中的遲緩期、對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期初期。

2.2 E.coli DH5α的 OD600-活菌細(xì)胞濃度圖

將10－4、10－5、10－6稀釋度的培養(yǎng)物涂布于無抗生素的LB平板培養(yǎng)基上以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞數(shù)，選取一組數(shù)據(jù)(見表2)經(jīng)線性化處理得E.coli DH5α 的 OD600-活菌細(xì)胞濃度圖(圖2)，使分光光度計(jì)讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化。由圖2可看出細(xì)菌細(xì)胞濃度與菌液光密度值成正比。

表1 E.coli DH5α的生長曲線Table 1 Growth curve of E.coli DH5α

圖1 E.coli DH5α的生長曲線Fig.1 Growth curve of E.coli DH5α

表2 E.coil DH5α的OD600-活菌細(xì)胞濃度Table 2 E.coil DH5α 的OD600-Viable cell concentration

2.3 不同生長時(shí)期的E.coli DH5α菌株轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

細(xì)菌在不同生長時(shí)期的活細(xì)胞濃度不同。要進(jìn)行不同生長時(shí)期轉(zhuǎn)化率的比較，必須調(diào)整細(xì)胞密度至相同情況。為達(dá)到高效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于 108細(xì)胞/mL。根據(jù) CaC12法，第 2次CaCl2處理時(shí)，活細(xì)胞濃度濃縮至2.5×109細(xì)胞/mL，轉(zhuǎn)化菌平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率(每微克DNA轉(zhuǎn)化后所產(chǎn)生的單菌落個(gè)數(shù)，菌落數(shù)/μg DNA)，見表3。結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率與OD600值顯著相關(guān)。E.coli DH5α菌株在OD600值為0.40～0.42時(shí)獲得最高轉(zhuǎn)化率。

圖2 E.coli DH5α的OD600值-活菌細(xì)胞濃度圖Fig.2 E.coli DH5α OD600-Viable cell concentration diagram

圖3 E.coil DH5α不同生長時(shí)期的轉(zhuǎn)化率Fig.3 Transformation of E.coil DH5α in the different fevelopment

表3 E.coil DH5α不同生長時(shí)期的轉(zhuǎn)化率Table 1 Transformation of E.coil DH5α in the different fevelopment

3 討論

細(xì)菌轉(zhuǎn)化率取決于細(xì)菌被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的能力以及細(xì)菌的數(shù)量，隨著細(xì)菌生長，單位體積內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目增加，細(xì)菌被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的能力有所下降，尤其當(dāng)生長過度后下降更為明顯［8］。因此，合適的生長濃度應(yīng)該能保證上述兩方面的綜合效應(yīng)處于理想范圍。

大腸埃希菌群體生長周期包括遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。結(jié)合所繪制的生長曲線可知:當(dāng) OD600值為 0.40 ～0.42 時(shí)，細(xì)菌正處在對(duì)數(shù)期的中期，此時(shí)，細(xì)菌處于最理想的生長狀態(tài)。細(xì)菌在該期生命力強(qiáng)，對(duì)轉(zhuǎn)化緩沖液的反應(yīng)性強(qiáng)，被誘導(dǎo)處于感受態(tài)的細(xì)菌較多［9］，本研究獲得轉(zhuǎn)化率為2×106～4×106cfu/μg DNA的感受態(tài)細(xì)胞，可完全滿足常規(guī)分子克隆操作對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的要求。同時(shí)研究還應(yīng)注意到，當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降，所以DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。

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