陳詠君，田素飛，褚云卓*，郭麗潔，丁麗萍，李富順

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽(yáng) 110001;2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬沈洲醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽(yáng) 110001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的常見(jiàn)病原菌之一，可以引起皮膚和全身的廣泛感染［1-2］。社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(community-acquired methicillin-resistantStaphylococcus aureusCA-MRSA)感染主要侵犯皮膚軟組織，感染類(lèi)型包括癤、膿腫、毛囊炎、蜂窩織炎等，嚴(yán)重時(shí)可引起膿毒癥，甚至導(dǎo)致壞死性肺炎。CA-MRSA可以產(chǎn)生多種毒素，主要有α型苯酚可溶解的調(diào)控蛋白(phenolsoluble modulins，PSMα)、葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)、葡萄球菌溶血素、殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)、表皮剝脫性毒素(exfoliative toxins，ETs)以及中毒性休克綜合征毒素-l(toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1)等［3］。我國(guó)CA-MRSA中ST59型為常見(jiàn)的基因型［4-5］，但其相關(guān)的毒力因子尚無(wú)系統(tǒng)報(bào)道，本文檢測(cè)了ST59型CA-MRSA的PSMα、PVL、SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因，以了解ST59的毒力因子，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 5株金黃色葡萄球菌菌株(P14，2997，E14，6048，6131)均來(lái)自2007～2008年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院門(mén)診及住院患者的臨床分離的非重復(fù)菌株，其中6048和6131分離自同一患者的不同標(biāo)本，其余來(lái)自不同患者的皮膚軟組織及血培養(yǎng)標(biāo)本。5株菌的mecA基因均為陽(yáng)性，SCCmecⅣ型［6-7］。5株金黃色葡萄球菌菌株經(jīng)MLST分析，均為ST59型CA-MRSA。

1.1.2 主要試劑與儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒(博日生物技術(shù)有限公司);Tag酶及PCR相關(guān)試劑(寶泰克大連生物科技有限公司);PCR引物(上海生工有限公司合成);菌種鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)、VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)、PCR9700(Gene Amp)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品)、HZQF160振蕩培養(yǎng)箱(上海);超速低溫離心機(jī)(貝克曼);紫外凝膠成像儀(美國(guó)Alpha Innotech)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)［8］，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PSMα、SEs、ETs、TSST-1、PVL 基因引物一覽表Table1 PSM2、SEs、ETs、TSST－1、PVL gene Primers list

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明提取基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，6×Buffer緩沖液5 μL，Taq酶(5 u/H1)0.25 μL，dNTP 3 μL，引物各4 μL，模板5 μL，加無(wú)菌去離子水至25 μL。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件 擴(kuò)增SEs基因熱循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性4 min，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min;擴(kuò)增ETA、ETB和TSST基因循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性4 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，循環(huán)30次，72℃1 min，72℃延伸1 min;擴(kuò)增PVL基因熱循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次，72℃延伸5 min。擴(kuò)增PSMα基因熱循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 1 g瓊脂糖粉末與100 mL 0.5×TBE緩沖液混合加熱煮沸，冷卻至80℃后，制備成1%的瓊脂糖凝膠。2 μL上樣緩沖液與5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后加入1%瓊脂糖凝膠孔，10×TBE為電泳緩沖液，用水平式電泳槽140 V，電流為80 mA，時(shí)間為40 min。EB染色20 min，300 nm紫外燈觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.5 DNA測(cè)序 對(duì)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的PSMα和PVL基因片段委托上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，與GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力因子檢出情況

5株ST59型CA-MRSA全部檢出PSMα基因(見(jiàn)圖1)和檢出PVL基因(見(jiàn)圖2);5株ST59型CA-MRSA均未檢出SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因。

圖1 α型苯酚可溶解的調(diào)控蛋白(phenol-soluble modulins，PSMα)Fig.1 Phenol-soluble modulins，PSMα

圖2 殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)Fig.2 Panton-Valentine leukocidin，PVL

2.2 測(cè)序結(jié)果

PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的5株P(guān)SMα和5株P(guān)VL基因片段測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4，與GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)完全一致。

圖3 PSMα基因測(cè)序結(jié)果Fig.3 The results of PSMα gene Sequencing

圖4 PVL基因測(cè)序結(jié)果Fig.4 The results of PVL gene Sequencing

3 討論

社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)已經(jīng)在世界各地廣泛流行，不同于醫(yī)院相關(guān)性MRSA(HA-MRSA)的顯著特性是可產(chǎn)生多種毒素，如α型苯酚可溶解的調(diào)控蛋白、腸毒素、溶血素、表皮剝脫性毒素、殺白細(xì)胞素等，多侵襲既往健康的社區(qū)人群，且頻繁發(fā)生壞死性肺炎及筋膜炎，給人類(lèi)的健康造成極大的威脅。

目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)過(guò)對(duì)ST59型CA-MRSA攜帶PSMα基因進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)的報(bào)道。在本研究中的5株CA-MRSA，mecA基因均為陽(yáng)性，SCCmec均為Ⅳ型，經(jīng)MLST分析均為ST59型。5株ST59型CA-MRSA經(jīng)PCR擴(kuò)增后均攜帶PSMα基因和PVL基因［6-7］。近來(lái)的研究對(duì)于PVL基因在CAMRSA菌株流行和致病中所起到的作用存在分歧，但在本研究中5株ST59型CA-MRSA均檢出PVL基因，因此認(rèn)為PSMα基因和PVL基因是ST59型CA-MRSA的常見(jiàn)毒力因子。事實(shí)上，PSMα基因強(qiáng)烈的影響對(duì)于CA-MRSA的感染在小鼠的菌血癥和膿腫模式已經(jīng)顯示的十分清楚［9］。在CA-MRSA的感染中PSMα基因具有很強(qiáng)的促炎和增強(qiáng)毒力的作用［8］。PSMα基因在ST59型CA-MRSA的感染中是否具有較強(qiáng)的促炎和增強(qiáng)毒力的作用將在今后的研究中繼續(xù)證明。

本研究中的5株ST59型CA-MRSA均未檢測(cè)出攜帶腸毒素SEA-SEE基因、TSST-1基因、ETA和ETB 基因，這與蔡朝陽(yáng)等［10－11］報(bào)道陽(yáng)性率為9.68%差異較大，考慮可能為不同標(biāo)本，不同地域，不同自然環(huán)境，金黃色葡萄球菌流行菌株也不同，其攜帶毒素基因亦不一樣。本研究中分離的標(biāo)本均為患者的皮膚軟組織及血培養(yǎng)標(biāo)本，并無(wú)水皰或廣泛皮膚脫落患者，考慮感染類(lèi)型不同，ST59型CA-MRSA攜帶毒素基因也不同。

總之，ST59型CA-MRSA的毒力和致病機(jī)制非常復(fù)雜，在克隆傳播和疾病的發(fā)病中可能涉及多種因素。人們一直在努力找到一種或幾種能夠確定的毒力因子來(lái)闡明ST59型CA-MRSA毒力增強(qiáng)的原因。對(duì)ST59型CA-MRSA毒力因子的認(rèn)識(shí)可以促進(jìn)抗ST59型CA-MRSA治療的發(fā)展。因此有必要進(jìn)一步研究上述毒力因子在ST59型CA-MRSA致病中的作用。

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