[摘 要] 冬蟲夏草是蝙蝠蛾幼蟲和寄生真菌中國被毛孢的復合體，是我國傳統(tǒng)中藥中的瀕危物種。關于冬蟲夏草及其無性型中國被毛孢已有很多研究報道，然而對于蝙蝠蛾幼蟲人工接種中國被毛孢和冬蟲夏草子囊孢子的侵染效果對比卻鮮有報道?；诖?，本研究采用中國被毛孢菌絲體和冬蟲夏草子囊孢子，分別在室內人工侵染養(yǎng)殖蝙蝠蛾幼蟲，并對侵染效果進行分析，結果表明，以中國被毛孢菌絲體懸液為菌種，接種成功率較低。

[關鍵詞] 冬蟲夏草;中國被毛孢;子囊孢子;蝙蝠蛾幼蟲

[中圖分類號] S567.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-7909（2020）07-105-2

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的特色中藥材，是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲子座上的復合物。冬蟲夏草生長在低溫缺氧的高山草甸上，且對環(huán)境要求非常嚴格，同時人們對其的掠奪式采挖導致了生態(tài)環(huán)境破壞，因此人們試圖通過人工來培育冬蟲夏草，充分發(fā)揮其經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。

目前，人們尚不清楚冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲的機制。楊大榮等指出，冬蟲夏草菌主要是通過子囊孢子黏附幼蟲新嫩表皮的方式進入其體腔從而形成冬蟲夏草[1]。本試驗采用冬蟲夏草的有性型子囊孢子和無性型中國被毛孢菌絲體這兩種接種體分別對寄主幼蟲進行侵染比較，為冬蟲夏草安全性研究方面以及人工培育子實體方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蟲種。3齡蟲草蝙蝠蛾幼蟲，采自四川省德陽縣蟲草基地，室內人工短期飼養(yǎng)。

1.1.2 菌種。一是天然有性型菌種。采自青海省玉樹藏族自治州的天然冬蟲夏草經(jīng)人工誘導其彈射、收集得到具有侵染能力的冬蟲夏草子囊孢子。二是固體培養(yǎng)無性型菌種。中國被毛孢（Hirsutella.sinensis）寄主是蝙蝠蛾幼蟲，菌種采自青海青沙山。

1.1.3 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基成分包括蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、麥芽糖10 g/L、瓊脂20 g/L、無水硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、檸檬酸三銨0.4 g/L、南京白敬宇制藥有限責任公司生產(chǎn)的復合維生素B片4片/L，蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)。在已滅菌的9 cm×12 cm養(yǎng)蟲盒里鋪上適宜幼蟲生長的高山草甸土，并種上幼蟲取食的植物珠芽蓼塊根（所有的土壤以及食物都要經(jīng)過紫外照射嚴格滅菌）。待植物成活后，把蝙蝠蛾幼蟲移入器皿內，每個器皿飼養(yǎng)兩只幼蟲?？諝鉂穸瓤刂圃?0%～85%，溫度控制在10～16 ℃，土壤含水量控制在40%～50%，避光飼養(yǎng)，每隔15 d換1次器皿與飼料。

1.2.2 蟲草子囊孢子的獲取。在不同的玻璃平皿內分別將子座膨大的新鮮蟲草標本的蟲體部分用滅菌的脫脂棉進行保濕，子座頭部懸于滅菌的載玻片上，置于16 ℃，光周期為12L∶12D的條件下進行誘導培養(yǎng)，5～10 d后可釋放子囊孢子。

1.2.3 斜面菌種培養(yǎng)。用已滅菌的接種針挑取少量實驗室固體斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基上，置于18 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落呈圓形凸起，顏色由灰白色轉淺黃褐色至黃褐色時置于4 ℃冰箱備用。

1.2.4 菌絲體懸液及子囊孢子懸液的制備。用已滅菌的接種針挑取少量培養(yǎng)的中國被毛孢菌絲體，置于無菌水中并用高速分散器打散，制成菌絲液備用。收集天然冬蟲夏草彈射在無菌載玻片上的子囊孢子，用已滅菌的涂布器將其刮入無菌水中，搖勻后備用。

1.2.5 接種培養(yǎng)

1.2.5.1 接種體。為研究冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲的機制，本研究分別以菌絲體懸液、子囊孢子懸液為接種體，每次分別侵染50只蝙蝠蛾幼蟲。

1.2.5.2 接種方式?？紤]到蝙蝠蛾幼蟲幾天就蛻皮一次，而蛻皮可能對浸濕侵染不利，故本試驗選擇在浸蘸接種后進一步采取穿刺接種法并同時將菌液混入幼蟲食物中，以增加侵染成功率。

1.2.6 接種后處理。接種后將幼蟲放入事先編號的已滅菌的培養(yǎng)皿中，僅飼喂少量珠芽蓼，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于16 ℃避光條件下培養(yǎng)。2 d后繼續(xù)給予珠芽蓼并注意補充無菌水以保濕培養(yǎng)，5 d后轉入土壤中繼續(xù)飼養(yǎng)。每隔4 d檢查統(tǒng)計幼蟲死亡情況并加入少量珠芽蓼（珠芽蓼均要求進行紫外照射、滅菌消毒）。

2 結果與分析

2.1 子囊孢子收集

將冬蟲夏草子實體的可孕部分橫切制片鏡檢，在顯微鏡下，可觀察到子囊細長，（247.0～420.0）μm×（7.0～10.0）μm，一端或兩端略尖，直或稍彎，子囊壁薄且透明。在子囊孢子發(fā)育初期可以明顯看到每個子囊里有1～8個子囊孢子，初期的子囊孢子呈球形或橢圓形，一個接一個地緊密排列在子囊中。有些含有子囊孢子的子囊比無子囊孢子的子囊要長。隨著子囊的發(fā)育，孢子逐漸伸長成為長橢圓形或絲狀，一個子囊中最終僅有一兩個或者是4個子囊孢子發(fā)育成熟并彈射出來。當發(fā)現(xiàn)載玻片上有灰白色細粉狀物時，用沾有無菌水的接種環(huán)黏取粉狀物制成子囊孢子懸液，境檢會看到典型的冬蟲夏草長橢圓形或絲狀子囊孢子。

2.2 菌種培養(yǎng)

中國被毛孢菌株生長緩慢，在固體培養(yǎng)基上，18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)180 d，菌落呈圓形凸起，堅硬，顏色呈灰褐色至黃褐色，且會產(chǎn)生黃褐色至暗褐色素滲入培養(yǎng)基中。

2.3 接種培養(yǎng)

2.3.1 子囊孢子懸液接種。供試幼蟲經(jīng)過冬蟲夏草的有性型子囊孢子懸浮液接種后60 d左右開始僵化死亡，用解剖刀剖開僵蟲鏡檢，可見僵蟲體腔內部分布大量菌絲（菌核），保濕培養(yǎng)一段時間后，白色菌絲體逐漸布滿僵蟲外表面。蟲體內部菌絲（菌核）形態(tài)較一致，菌絲多分叉，并有菌絲纏繞形成的結節(jié)（菌核）（見圖1B），從形態(tài)學上觀察該菌絲（菌核）與冬蟲夏草體內的菌絲（菌核）較相似（見圖1A）。

2.3.2 中國被毛孢菌絲體懸液接種。供試幼蟲經(jīng)過冬蟲夏草的無性型中國被毛孢菌絲體懸浮液接種40 d左右就出現(xiàn)幼蟲僵硬死亡，有些蟲體表面菌絲較少，有些僵蟲體表有較多白色菌絲，甚至出現(xiàn)綠色孢子或孢梗束，顯然后者為雜菌感染。

挑取僵蟲組織或體表的菌絲制片，在顯微鏡下觀察。在放大10×40倍時，可看到有些僵蟲上菌絲或組織樣品中有典型的球孢白僵菌產(chǎn)孢結構，有些有綠僵菌或擬青霉產(chǎn)孢結構，因此剔除這些非目標菌感染樣品。余下的中國被毛孢無性型侵染所得的僵蟲體內可見有大量的菌絲體和菌核，形態(tài)較一致（見圖2B），從形態(tài)學上觀察與冬蟲夏草較相似（見圖2A）。

3 結論

本試驗通過人工收集天然冬蟲夏草彈射的子囊孢子并將制得的子囊孢子懸液作為接種體，用于侵染蝙蝠蛾幼蟲，最終通過形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)在接種后60 d左右開始形成僵蟲，保濕培養(yǎng)一段時間后，僵蟲外表面出現(xiàn)菌絲，用解剖刀剖開僵蟲，制片鏡檢可以觀察出由子囊孢子懸液侵染所得的僵蟲體內有大量的菌絲（菌核），形態(tài)一致，菌絲分叉有結節(jié)，從菌絲形態(tài)學上觀察與冬蟲夏草菌絲（菌核）較相似。將制得的中國被毛孢菌絲體懸液作為接種體時，在采用同樣的接種方式進行侵染以后40 d左右形成僵蟲，有些蟲體表面菌絲較少，有些雜菌感染的僵蟲表面菌絲較多，甚至有孢梗束以及白色或其他顏色的孢子，表明以中國被毛孢菌絲體懸液為菌種接種成功率較低。給蝙蝠蛾幼蟲人工接種中國被毛孢較易污染雜菌，如果沒有進一步分析而將其盲目用作冬蟲夏草的替代品，可能存在安全隱患。在進行大規(guī)模人工培養(yǎng)冬蟲夏草及其替代品的實際操作中，對于如何避免雜菌污染，從而確保其產(chǎn)品的有效性和安全性仍需要深入研究。

參考文獻

[1]楊大榮，沈發(fā)榮，楊躍雄，等.蟲草蝠蛾生態(tài)學的研究Ⅲ.幼蟲越冬與生理調節(jié)[J].動物學研究，1988（s1）：43-49.

作者簡介：韓曉然（1992—），女，農(nóng)學碩士，研究方向：森林保護學。