石 宏，吉長福，尚紅燕，辛娟娟，楊兆坤，宿楊帥，王曉宇，何 偉，景向紅

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

ASIC3-/-和TRPV1-/-純合子小鼠是以正常近交系C57BL/6為背景，利用基因敲除技術(shù)將相關(guān)基因定點(diǎn)滅活制備而成的動物模型。純合子ASIC3-/-是靶點(diǎn)突變小鼠，它表現(xiàn)出正常及與疼痛相關(guān)的皮膚機(jī)械敏感性、炎癥疼痛感覺的改變，視力減退伴夜盲癥及年齡引起的聽力損失的改變。ASIC3-/-小鼠的機(jī)械感受器對于輕觸表現(xiàn)出更高敏感性，而且對傷害性機(jī)械刺激敏感性是下降的［1］，對酸以及傷害性的熱刺激敏感性下降。TRPV1-/-小鼠是純合的定點(diǎn)突變小鼠，對本品系的純合小鼠皮下注射辣椒素，不會引起疼痛，腫脹也受到顯著抑制，體溫也不會降低。純合小鼠的熱致疼痛相關(guān)行為表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷，而且不會反感飲用添加了辣椒素的水。

ASIC3-/-和TRPV1-/-純合子小鼠常用于痛覺相關(guān)研究。目前對于C57BL/6繁殖性能報(bào)道較多，但對ASIC3-/-及TRPV1-/-小鼠的繁殖性能及在喂養(yǎng)過程中存在的問題目前國內(nèi)尚未見到報(bào)道。我們在ASIC3-/-及TRPV1-/-小鼠動物使用繁飼養(yǎng)殖中積累了一些數(shù)據(jù)，并對它進(jìn)行了整理，同時(shí)以C57BL/6小鼠作為對照組與ASIC3-/-和TRPV1-/-純合子小鼠進(jìn)行了基礎(chǔ)痛閾值的比較，為繁殖使用這類基因小鼠的同行提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

動物品系:ASIC3-/-小鼠、TRPV1-/-小鼠、C57BL/6小鼠。

動物來源:ASIC3基因敲除小鼠(Stock Number:013127)，品系為 B6.129-Asic3tm1Wsh/J，TRPV1 基因敲除小鼠(StockNumber:003770)品系為B6.129S4-Trpv1tm1Jul/J，兩種小鼠均為純合子小鼠，從美國JAX實(shí)驗(yàn)室引進(jìn);C57BL/6來自中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心，動物許可證號【Scxk(京)2009-0017】。

動物選擇:TRPV1-/-和ASIC3-/-純合子小鼠通過檢驗(yàn)檢疫，飼養(yǎng)，繁殖，測序鑒定，檢測合格后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。選用性成熟未交配過的TRPV1-/-和ASIC3-/-純合子小鼠各12只(雌雄各半)進(jìn)行交配。TRPV1-/-小鼠8～10周齡左右，體重20～25 g。ASIC3-/-小鼠8～10周齡左右，體重在20～25 g。C57BL/6小鼠12只(雌雄各半)，8～10周齡左右，體重20 ～25 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

動物飼養(yǎng)在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動物房SPF級屏障設(shè)施內(nèi)(實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號【SYXK(京)2010-0032】室內(nèi)溫度控制在20～25℃，濕度控制在40% ～70%，全程喂飼北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的大小鼠生長繁殖飼料。飼料、墊料、飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，動物飲水為酸化純凈水(pH2.5～3.0)，每周更換墊料飲水1～2次，光暗照明12 h交替，飼養(yǎng)流程嚴(yán)格按照屏障設(shè)施SOP操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

溫度測痛儀(UGO basile tail flick unit 37360，意大利)，觸覺測痛儀(UGO Basile Dynamic Plantar Aesthesiometer 37450，意大利)。

1.4 觀察方法

1.4.1 ASIC3-/-、TRPV1-/-純合子小鼠分別按性別分籠飼養(yǎng)，8周齡左右開始配種，采用1只雄鼠和1只雌鼠同居的方式進(jìn)行交配繁殖。觀察6個(gè)月內(nèi)小鼠妊娠的胎次，妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、頭胎產(chǎn)仔數(shù)等。

1.4.2 測定 C57BL/6小鼠、ASIC3-/-、TRPV1-/-純合子小鼠的基礎(chǔ)機(jī)械痛閾值和溫度閾值。機(jī)械痛閾值測定［2］:使用觸覺測痛儀，測小鼠的抬腳反射潛伏期(單位 S)。熱痛閾值測定［3］:待動物安靜后，將溫度測痛儀的聚光光源聚集于大鼠足底部，測定其熱輻射縮腿反應(yīng)潛伏期(單位S)。從記錄開始到抬足的時(shí)間作為相應(yīng)的痛閾值。每只動物測量三次，取其即刻效應(yīng)平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除小鼠的繁殖情況分析

ASIC3-/-和TRPV1-/-小鼠均觀察半年內(nèi)的繁育情況，在ASIC3-/-種鼠中，只有3只雌鼠全部妊娠，另有2只雌鼠妊娠二次，1只雌鼠僅妊娠一次，總體妊娠率為77.8%，每窩平均產(chǎn)仔數(shù)5.64只、離乳仔數(shù)3.5只，離乳率57.14%。TRPV1-/-的每只雌鼠在半年內(nèi)均妊娠三次，妊娠率100%，每窩產(chǎn)仔數(shù)6.5只、離乳仔數(shù)5只、離乳率79%。經(jīng)過比較ASIC3-/-小鼠從妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳數(shù)、離乳率都不及TRPV1-/-小鼠，而TRPV1-/-小鼠從產(chǎn)仔數(shù)及離乳率方面都相對穩(wěn)定(表1)。

表1 ASIC3-/-小鼠與TRPV1-/-小鼠繁殖性能的比較()Tab.1 Reproduction Performance in ASIC3-/-and TRPV1-/-

表1 ASIC3-/-小鼠與TRPV1-/-小鼠繁殖性能的比較()Tab.1 Reproduction Performance in ASIC3-/-and TRPV1-/-

離乳率(%)Weaning rate ASIC3-/- 77.8±42.78 5.64±1.60 3.5±3.48 57.14±51.36 TRPV1-/-品系Strain妊娠率(%)Gestate rate窩產(chǎn)仔數(shù)(只)Baby/litter離乳仔數(shù)(只)Wean number 100±0 6.44±1.76 5.06±2.84 79.03±37.40

表2 ASIC3-/-小鼠與TRPV1-/-小鼠不同胎次繁殖性能的比較()Tab.2 Reproduction Performance of different birth sequence in ASIC3-/-and TRPV1-/-

表2 ASIC3-/-小鼠與TRPV1-/-小鼠不同胎次繁殖性能的比較()Tab.2 Reproduction Performance of different birth sequence in ASIC3-/-and TRPV1-/-

第一胎1st Gestate 第二胎離乳率(%)Weaning rate ASIC3-/- 5±1.26 33.33±51.64 7.0±1.58 80±44.72 4.67±0.57 66.67±57.74 TRPV1-/- 5.5±1.87 49.60±49.77 7.17±1.72 97.92±5.10 6品系Strain 2nd Gestate 第三胎3rd Gestate產(chǎn)仔數(shù)(只)Baby/litter離乳率(%)Weaning rate產(chǎn)仔數(shù)(只)Baby/litter離乳率(%)Weaning rate產(chǎn)仔數(shù)(只)Baby/litter.67±1.51 89.58±25.52

ASIC3-/-小鼠頭胎產(chǎn)仔數(shù)是5只，離乳率33.33%、第二胎產(chǎn)仔增加為7只左右，離乳率達(dá)到80%，第三胎時(shí)產(chǎn)仔數(shù)減少到與第一胎一致，但離乳率要高于第一胎，達(dá)到66.67%。TRPV1-/-小鼠的頭胎產(chǎn)仔數(shù)均為5只左右，頭胎的離乳率50%，而第二胎和第三胎TRPV1-/-小鼠產(chǎn)仔數(shù)增多，都在7只左右，離乳率也分別升高到97.92%和89.58%(表2)。

從表2中可以看出，TRPV1-/-小鼠頭胎生育及離乳率低些，第二、三胎繁殖情況趨于穩(wěn)定，而ASIC3-/-小鼠的繁殖不是很穩(wěn)定，離乳率也低于TRPV1-/-小鼠。

經(jīng)分析ASIC3-/-小鼠離乳率偏低與ASIC3-/-小鼠的食仔及棄養(yǎng)情況偏高有關(guān)，例如第一次妊娠生產(chǎn)的4只ASIC3-/-小鼠中有3只全部棄養(yǎng)或食仔，第二次妊娠生產(chǎn)的5只小鼠中有1只全部棄養(yǎng)，第三次妊娠的5只小鼠有2只全部棄養(yǎng)。這一方面說明ASIC3-/-小鼠母性不強(qiáng)，另一方面也可能與這種小鼠本身的基因缺陷有關(guān)。

2.2 三組小鼠基礎(chǔ)機(jī)械痛閾和熱痛閾值的比較

我們對三組小鼠的基礎(chǔ)痛閾值進(jìn)行了測定，經(jīng)比較三組小鼠的基礎(chǔ)痛閾值顯著不同，其中ASIC3-/-組的機(jī)械痛閾值與 C57BL/6組和TRPV1-/-組相比顯著升高(P＜0.001，圖 1)，說明ASIC3-/-小鼠的機(jī)械感受能力下降，而ASIC3-/-組與C57BL/6組熱痛閾值相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，圖2);TRPV1-/-組與C57BL/6對照組機(jī)械痛閾值相比沒有無顯著差異(P＞0.05，圖1)，而其熱痛閾值較其他兩組顯著升高(P＜0.001，圖2)。說明TRPV1-/-小鼠的對熱感受能力下降。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的觀察表明ASIC3-/-小鼠的妊娠次數(shù)低于TRPV1-/-小鼠30%左右，每窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳仔數(shù)、離乳率也低于 TRPV1-/-小鼠，這可能和ASIC3-/-小鼠對機(jī)械感受的靈敏度下降有關(guān)，這種機(jī)械感受的下降除了造成對機(jī)械痛的感受遲鈍以外，還造成了喂養(yǎng)能力和母性的下降。而TRPV1-/-小鼠的繁育情況相對穩(wěn)定。TRPV1-/-小鼠雖然其對熱的感受能力下降，但是其喂養(yǎng)能力和母性沒有影響。這些結(jié)果提示我們對于ASIC3-/-小鼠這種動物的喂養(yǎng)和繁殖需要注意。

注:＊＊＊P ＜0.001，與 C57BL/6 小鼠比較 n=12;☆☆☆P ＜0.001，與 TRPV1-/-小鼠比較(n=12)。圖1 三組小鼠間基礎(chǔ)機(jī)械痛閾值的比較()Note: ＊＊＊P ＜0.001，compared with C57BL/6 mice(n=12);☆☆☆P＜0.001，compared with TRPV1-/-mice(n=12).Fig.1 Comparison of basal tactile threshold among three groups()

注:＊＊＊P ＜0.001，與 C57BL/6 小鼠比較 n=12;☆☆☆P＜0.001，與 ASIC3-/- 小鼠比較(n=12)。圖2 三組小鼠間基礎(chǔ)熱痛閾值的比較()Note: ＊＊＊P ＜0.001，compared with C57BL/6 mice(n=12);☆☆☆P＜0.001，compared with ASIC3-/-mice(n=12).Fig.2 Comparison of basal thermal threshold among three groups()

在小鼠的繁育期間我們還發(fā)現(xiàn)母鼠有棄養(yǎng)和食仔現(xiàn)象。在環(huán)境、飲食相同的情況下，ASIC3-/-小鼠的棄養(yǎng)、食仔現(xiàn)象多于 TRPV1-/-小鼠。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)個(gè)別小鼠有脫毛現(xiàn)象，有的是成年小鼠脫毛，也有的是新生小鼠脫毛，脫毛的小鼠基本上是同一籠中的小鼠，脫毛部位頭部偏多，背部也有。經(jīng)過查閱資料得知C57系小鼠對營養(yǎng)要求較高，對營養(yǎng)變化極為敏感，除要用專用小鼠飼料外還需補(bǔ)充維生素E等增加營養(yǎng)，所以我們對哺乳期母鼠增加喂飼蛋黃，給所有小鼠增加葵花籽，胡蘿卜、蘋果等輔助飼料，經(jīng)過補(bǔ)充營養(yǎng)，脫毛現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，毛色光亮。小鼠的脫毛情況雖是個(gè)別現(xiàn)象，但從個(gè)例中也可以看出TRPV1-/-小鼠脫毛比例略高于ASIC3-/-小鼠，而TRPV1-/-小鼠也要比 ASIC3-/-小鼠更活躍些。這些現(xiàn)象的原因有待于進(jìn)一步觀察和研究。

近年來研究還顯示，ASIC3與痛覺及傷害感受器密切相關(guān)。在酸化條件下所致的傷害和疼痛感受中，ASIC3是主要的酸感受器之一。不僅在哺乳動物的大腦、背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)、胃內(nèi)神經(jīng)、視網(wǎng)膜、感覺神經(jīng)等處有 ASIC3表達(dá)，而且在心、肺、骨、骨骼肌、睪丸、味蕾、皮膚神經(jīng)末梢等也有ASIC3的表達(dá)［4，5］。Jackson的網(wǎng)站上對所提供 ASIC3這種品系的基因敲除小鼠的描述是:該小鼠為純合的靶點(diǎn)突變小鼠，它表現(xiàn)出正常及與疼痛相關(guān)的皮膚機(jī)械敏感性、炎癥疼痛感覺的改變，視力減退伴夜盲癥及年齡引起的聽力損失的改變。

Price 等［6，7］的研究發(fā)現(xiàn) ASIC3 基因敲除小鼠對輕觸覺的反應(yīng)性是增強(qiáng)的，張穎等［8］在基因敲除研究中還發(fā)現(xiàn)ASIC3可能參與高強(qiáng)度痛覺感知的調(diào)節(jié)。這些為ASIC3在觸覺中的作用提供了有力的證據(jù)。

TRPV1 為熱敏感離子通道［9，10］，主要分布在中和小傷害性感受神經(jīng)元上，研究提示TRPV1可能參與了與痛覺相關(guān)上下游通路上多個(gè)水平的調(diào)節(jié)［11］。目前TRPV1作為一類與痛覺傳遞有密切聯(lián)系的離子通道受體已廣泛應(yīng)用于調(diào)控痛覺的機(jī)制研究。

Jackson提供的TRPV1基因敲除小鼠為純合的定點(diǎn)突變小鼠，它體型正常，可以繁育，不會表現(xiàn)出明顯的身體和行為異常，在背根神經(jīng)節(jié)檢測不到基因產(chǎn)物(mRNA或蛋白)。當(dāng)環(huán)境酸化或環(huán)境溫度達(dá)到43℃時(shí)，或環(huán)境中存在辣椒素化合物時(shí)，體外培養(yǎng)的背根中樞神經(jīng)元和制備的皮膚對辣椒素化合物不表現(xiàn)反應(yīng)或反映受到顯著抑制。在未受損的野生型鼠后爪皮下注射辣椒素，會引起疼痛并出現(xiàn)腫脹。但對于本品系的純合小鼠，不會引起疼痛，腫脹也受到顯著抑制。也有的研究表明，TRPV1基因敲除小鼠對外周熱刺激的反應(yīng)比野生型小鼠相比明顯降低，而對機(jī)械痛的反應(yīng)無差異［12，13］，這和本實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)結(jié)果一致。

在病理狀態(tài)下，疼痛是疾病的主要癥狀之一。ASIC3和TRPV1作為參與痛覺的離子通道，在痛覺的傳導(dǎo)過程中起著重要的作用?，F(xiàn)在基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)有力的推動ASIC3和TRPV1受體的相關(guān)研究，這樣得到的結(jié)果比過去采用神經(jīng)纖維阻斷得到的結(jié)果更直接更有說服力。但是關(guān)于這種動物飼養(yǎng)方面的工作報(bào)道不多，還需要我們總結(jié)和積累經(jīng)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果可以為 ASIC3-/-、TRPV1-/-小鼠的喂養(yǎng)和繁殖提供參考，為這種實(shí)驗(yàn)動物引入疼痛的研究提供借鑒作用。

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