孫理軍 黨照麗 王 震 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

本研究以中醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)，采用貓嚇鼠的經(jīng)典造模方法［1］，造成具有中醫(yī)體質(zhì)理論特色的腎虛質(zhì)動(dòng)物模型，并在大量文獻(xiàn)研究和臨床研究的基礎(chǔ)上，將腎藏象理論和現(xiàn)代免疫學(xué)知識(shí)結(jié)合，提出了腎虛體質(zhì)防御、修復(fù)適應(yīng)能力降低與免疫功能失調(diào)密切相關(guān)的假設(shè)，從差異性角度研究腎藏象理論，根據(jù)腎虛體質(zhì)的生理病理特點(diǎn)，結(jié)合前期研究成果，以及細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中的作用特性，進(jìn)一步篩選出腎虛質(zhì)的特異血清免疫分子標(biāo)志物，為腎藏象理論的現(xiàn)代研究提供范式，豐富和發(fā)展腎藏象理論。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)SD 雄性大鼠30只，體重350g±20g，3月齡SPF級(jí)SD 雌性大鼠30只，體重250g±20g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證是SCXK（陜）2007－001，自由飲食飲水，室溫飼養(yǎng)。3月齡貓2只，兇狠善叫，喂食鮮活大鼠，室溫飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 桂附地黃丸（原名金匱腎氣丸，蘭州佛慈制藥有限公司提供，批號(hào)10c7，每丸含生藥量0.375g），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20090205），氯化鈉注射液（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)091116122），無(wú)水乙醇（天津市紅巖化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)20091016），IFN－γ、TNFα、IL－6ELISA 試劑盒（均由上海西唐生物科技有限公司提供，批號(hào)分別為：1007231，1007181，1007271），IL－10ELISA 試劑盒（由武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)為：138658）

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－Tek ELX808IU），電子精密天平（美國(guó)賽多利斯），醫(yī)用低溫冰箱（MDF－330，日本產(chǎn)），全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋mLS－3780），低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司KDC－40），電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司DKZ系列）。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 模型建立 參照我們以往建立腎虛質(zhì)大鼠模型的方法［2］，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周無(wú)異常后，將30只雌性大鼠隨機(jī)分為2組：腎虛質(zhì)雌鼠組20只，正常質(zhì)雌鼠組10只，將雄性大鼠與雌性大鼠按1：1比例合籠配對(duì)5d后，檢測(cè)雌鼠陰栓判斷其是否懷孕，然后將腎虛質(zhì)組孕鼠放于特制大鼠籠內(nèi)，于每天定時(shí)進(jìn)行恐嚇，直到其生產(chǎn)為止。正常組孕鼠，不予恐嚇，讓其自然待產(chǎn)。待兩組孕鼠分娩后，將生產(chǎn)的子鼠在不予恐嚇的情況下飼養(yǎng)滿(mǎn)60日齡后進(jìn)行分組，隨機(jī)選取正常組孕鼠所產(chǎn)雄性子鼠8只作為空白組，選取腎虛質(zhì)組孕鼠所產(chǎn)雄性子鼠16只，隨機(jī)分為模型組及藥物組，每組8只。將模型組和藥物組的16 只子代鼠于每日定時(shí)進(jìn)行恐嚇，持續(xù)1 個(gè)月。空白組不予恐嚇，其余時(shí)間各組均置于同一實(shí)驗(yàn)室，保證非處理因素一致。

2.2 給藥方法 大鼠給藥量按文獻(xiàn)折算［3］，大鼠的用藥量約為人的6.25倍。桂附地黃丸每8丸含生藥量為3g，成人每日服生藥量為9g，則大鼠每日服生藥量為0.9375g／kg，用蒸餾水配成0.09375g／mL 混懸液，備用。對(duì)子代鼠恐嚇的同時(shí)開(kāi)始灌胃，藥物組給予桂附地黃丸混懸液，空白組和模型組皆給予等量生理鹽水，10mL／kg，每日1次，共30d。

2.3 標(biāo)本采集與處理 灌胃60d后分別處死，處死前禁食12h，翌日采用心臟取血方式，取血2mL，然后將其以3000轉(zhuǎn)／分離心15min，分離血清，置離心管內(nèi)，保存于－20℃冰箱待測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè) IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α的檢測(cè)：使用美國(guó)Bio－Tek公司產(chǎn)品ELX808IU 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒是采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具體操作步驟按照R＆D 公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行檢測(cè)及計(jì)算。

3 結(jié) 果各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α的比較，見(jiàn)表1

表1 各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α 的比較（±s）

表1 各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α 的比較（±s）

注：與空白組比較△P＜0.05。

組別n IL－6（pg／mL）IL－10（pg／mL）IFN－γ（pg／mL）TNF－α（pg／mL）空白組8 53.29±37.11 135.91±94.74 49.27±18.55 177.92±67.27模型組8 89.95±37.11 62.59±50.57 27.91±9.51△337.70±80.58△藥物組8 76.72±25.22 107.52±93.60 34.49±10.16 277.48±73.48

如表1所示，與空白組相比，模型組IL－10、IFN－γ的含量均降低，IL－6、TNF－α含量升高，其中IFN－γ的降低和TNF－α的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比，藥物組IL－10、IFN－γ的含量均升高，IL－6，TNF－α含量降低，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討 論 腎為先天之本，正氣之根，腎中精氣的盛衰是決定機(jī)體正氣強(qiáng)弱的重要因素。腎中精氣充足，則正氣旺盛，機(jī)體能夠抵抗外邪的侵襲，不易發(fā)??；反之，腎中精氣不足，則機(jī)體正氣化生不足，致使防御能力下降，外邪易乘虛侵襲而發(fā)病?，F(xiàn)代研究表明，腎與免疫功能密切相關(guān)［4］，細(xì)胞因子的研究進(jìn)展是免疫學(xué)研究中最為突出的成果之一。細(xì)胞因子在免疫－神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著重要的介質(zhì)作用，它的含量改變必然會(huì)破壞這一網(wǎng)絡(luò)的平衡狀態(tài)，進(jìn)而破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及內(nèi)外環(huán)境的統(tǒng)一，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［5］。前期實(shí)驗(yàn)研究表明腎虛質(zhì)與細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答有一定的關(guān)系，為了全面探討腎虛質(zhì)大鼠免疫穩(wěn)態(tài)失衡的分子機(jī)理，可深入研究在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞因子，進(jìn)一步篩選出腎虛質(zhì)的特異性免疫分子標(biāo)志物。

本研究選擇細(xì)胞因子中具有代表性的IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α作為觀察指標(biāo)從分子水平研究其含量變化與腎藏象理論的相關(guān)性。其中IFN－γ和TNF－α是由Th1淋巴細(xì)胞分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IFN－γ、TNF－α由Th2淋巴細(xì)胞分泌，輔助體液免疫應(yīng)答，在過(guò)敏性疾病和感染性疾病中發(fā)揮作用。IFN－γ是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，能通過(guò)增強(qiáng)Th1細(xì)胞的活性而增強(qiáng)細(xì)胞免疫；通過(guò)抑制Th2的細(xì)胞增殖而抑制體液免疫。通過(guò)其細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種蛋白和酶，通過(guò)不同途徑、不同機(jī)制發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。IL－10是免疫過(guò)程中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫抑制活性，它能抑制IL－6、TNF－α等促炎因子的產(chǎn)生和釋放［6］。TNF－α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，由活化的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，參與炎癥多方面病理變化。IL－6也是炎癥反應(yīng)中一種重要的細(xì)胞因子，可促進(jìn)B 細(xì)胞增殖分化，并誘導(dǎo)其分泌抗體，促進(jìn)T 細(xì)胞產(chǎn)生IL－2，并作為致熱原刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞引起機(jī)體發(fā)熱，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)模型組大鼠IL－6、IL－10、的含量與空白組大鼠比均降低，IL－6、TNF－α含量與空白組大鼠比則升高。IFN－γ則可增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，而模型組大鼠可見(jiàn)其均降低，反映大鼠在受驚嚇之后機(jī)體免疫功能的降低；IL－6、TNF－α為促炎因子，其血清含量的升高可提示大鼠在長(zhǎng)期受驚嚇的情況下會(huì)導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生促炎因子的升高，IL－10是公認(rèn)的抑炎因子，模型大鼠IL－6、TNFα產(chǎn)生增多，IL－10生成減少，出現(xiàn)致炎因子與抑炎因子之間失衡，而致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂。使用藥物對(duì)模型組大鼠進(jìn)行干預(yù)后，可見(jiàn)IL－10、IFN－γ的含量升高，IL－6，TNF－α含量降低，可證機(jī)體的免疫功能的降低及紊亂得到了一定的糾正。研究結(jié)果表明：腎虛質(zhì)大鼠與細(xì)胞因子參與的免疫應(yīng)答有一定的關(guān)系。

［1］ 王米渠，馬向東，段光周，等.“腎為先天之本”行為遺傳中關(guān)于“恐傷腎”的表征［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1997，3（4）：23－25.

［2］ 孫理軍，李翠娟，王 震，等，腎虛質(zhì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的構(gòu)建方法與評(píng)價(jià)［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（1）：247－249.

［3］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：332－335.

［4］ 孫理軍，郝 蕊，薛 昶，等.腎虛質(zhì)大鼠CD4＋、CD8＋T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平的研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（12）：1671－1672.

［5］ 朱長(zhǎng)庚，李正莉.細(xì)胞因子與免疫－神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［J］.解剖學(xué)報(bào)，1996，27（4）：339－344.

［6］ Skapenko A，Gerald U，Niedobitek，J R，et al.Generation andregulation of human Th1－biased immune responsesin vivo：acritical role for IL－4and IL－10［J］.J Immunol，2004，172（10）：6427－6434.