金麗艷，胡 英，黃 欣，王秀娟，張雙元

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧810000;2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

FAS基因?qū)儆谀[瘤壞死因子受體超家族成員［1］，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［2］。FAS基因啟動(dòng)子區(qū)含有兩個(gè)重要多態(tài)位點(diǎn)［3］，其中一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)的沉默子第1377位，在該位點(diǎn)發(fā)生CG→CA轉(zhuǎn)換，破壞了轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn)(CACGCCC)，從而影響FAS基因的表達(dá)［4］，可能致死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)，使細(xì)胞發(fā)生癌變。本研究觀察了FAS-1377基因多態(tài)性與青海地區(qū)乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2012年11月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的330例女性乳腺癌患者，剔除非漢族資料及病理資料不全者，余233例納入研究?；颊吣挲g26～83歲，中位年齡47歲。TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期129例，Ⅲ期62例，Ⅳ期9例，分期不明19例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者90例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者93例，轉(zhuǎn)移情況不明者50例。

1.2 FAS-1377基因多態(tài)性檢測 采集乳腺癌患者手術(shù)前外周抗凝血標(biāo)本(EDTA-Na2抗凝)5 mL，用血液DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取外周血DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析檢測 FAS-1377(rs2234767)基因型。引物序列參照文獻(xiàn)［5］，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。上游引物序列5'-TGT GTG CAC AAG GCT GGC GC-3';下游引物序列5'-TGC ATC TGT CAC TGC ACT TAC CAC CA-3'。PCR反應(yīng)體系25μL，含100 ng模板DNA，10μmol/L上、下游引物各1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL(天根生化科技北京有限公司)，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火溫度為64℃，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)后，72℃最終延伸10 min。20μL PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BstUⅠ(北京紐英倫生物技術(shù)有限公司)于60℃孵育2 h以上，酶切產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)電泳(70 V，60 min)后用凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件。以χ2檢驗(yàn)分析FAS-1377多態(tài)性與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系。檢驗(yàn)方法均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 酶切結(jié)果 FAS-1377純合突變型AA產(chǎn)生122 bp一個(gè)片段，純合野生型GG產(chǎn)生104、18 bp兩個(gè)片段，雜合型GA基因產(chǎn)生122、104、18 bp三個(gè)片段(見圖1)。

圖1 FAS-1377酶切電泳圖

2.2 FAS-1377基因型分布 FAS-1377基因純合野生型GG分布頻率為21.0%(49/233)、雜合型GA為56.7%(132/233)、純合突變型 AA 為22.3%(52/233)。

2.3 FAS-1377基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 見表1。

3 討論

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間不平衡是腫瘤形成的基礎(chǔ)，F(xiàn)AS基因是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子之一，而其啟動(dòng)子區(qū)存在的FAS-1377多態(tài)位點(diǎn)可導(dǎo)致FAS基因低表達(dá)［3，6］，F(xiàn)AS表達(dá)減少是許多腫瘤惡變的共性，與大多數(shù)腫瘤的發(fā)展相關(guān)［7］。有很多證據(jù)表明FAS表達(dá)減少可能保護(hù)變異細(xì)胞，減少其被宿主免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致免疫逃逸［8］。在許多惡性腫瘤中，F(xiàn)AS表達(dá)減少成為一種惡性表型的特征［9］。目前FAS-1377多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)系的研究較多，但尚無一致性結(jié)論。乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一［10］。本課題主要研究凋亡基因 FAS-1377位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。

表1 FAS-1377基因多態(tài)性與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

國內(nèi)張柏林等［11］研究了840例乳腺癌患者和840例正常人 Fas-1377G/A、-670A/G和 FasL基因(-844T/C和7896G/C)基因多態(tài)性對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):攜帶Fas-1377AA和GA基因型患者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增高。Knechtel等［12］對216個(gè)淋巴結(jié)陽性的乳腺癌婦女檢測了包括FAS-1377和-670的16個(gè)基因多態(tài)性，單因素分析發(fā)現(xiàn)FAS-1377基因多態(tài)與無病生存率和總生存率顯著相關(guān)。Krippl等［13］對500例女性奧地利白種人乳腺癌患者和500例正常對照進(jìn)行病例對照研究，結(jié)果顯示FAS-1377A等位基因與較高的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。然而Crew等［14］在美國紐約研究1 053例乳腺癌患者和1 102例健康人FAS和FASL基因多態(tài)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS-1377G/A基因多態(tài)與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無顯著聯(lián)系，也沒有證據(jù)顯示該基因多態(tài)與年齡和雌激素水平等相關(guān)。Hashemi等［15］對伊朗134例乳腺癌患者和152例正常女性進(jìn)行FAS-1377 G/A(rs2234767)基因多態(tài)和乳腺癌的聯(lián)系的研究，發(fā)現(xiàn)FAS-1377基因多態(tài)性分布在這兩組間并無顯著不同。Li等［16］對中國314例原發(fā)性宮頸癌患者和615例健康人進(jìn)行FAS-1377、FAS-670、FASL-844基因型檢測，分析發(fā)現(xiàn)FAS和FASL基因多態(tài)性與臨床分期、細(xì)胞分化、腫瘤大小等無相關(guān)性。本研究中，F(xiàn)AS-1377基因多態(tài)與乳腺癌年齡及臨床分期等臨床病理指標(biāo)間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;關(guān)于兩者的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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