田 莉，張 凌，杜 戎，朱元洲，柯琴梅，祝建芳

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢430022)

進行性肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種致死性的常見肌肉遺傳疾病。根據(jù)目前研究，DMD發(fā)病多與遺傳因素有關(guān)［1］。在眾多確定與DMD發(fā)病有關(guān)的致病基因中，抗肌萎縮蛋白基因(Dystrophin基因)備受關(guān)注。Dystrophin基因位于X染色體短臂(Xp 21.1-3)，是目前已知最長的人類基因。根據(jù)國外報道，其主要突變類型為基因部分缺失，占全部突變類型的60% ～65%［2～4］。本研究以Dystrophin基因為候選基因，對一個中國DMD家系成員進行了基因突變檢測，以期了解Dystrophin基因突變情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 該DMD家系來自中國河南，其家系有1例確診患者(先證者)，家系圖見圖1。此患者為15歲男性，近半年出現(xiàn)進行性肌無力，無既往特殊病史和家族史，其血清肌酸激酶明顯增高。我們對此家系的所有成員進行臨床調(diào)查，包括是否出現(xiàn)肌無力和肌萎縮、肌酶變化、家族史等，并作全面肌酶檢測。陽性患者符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn):①以緩慢進行性的對稱性肢體近端肌萎縮和肌無力為主癥，呈翼狀肩胛、鴨步、肌病面容或假性肥大等征象，但無肌肉壓痛，Gower征陽性;②多在兒童和青少年期發(fā)病，常有家族遺傳史;③尿肌酸增加，肌酐減少，血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶等增高，血、尿肌紅蛋白增高;④肌電圖可見自發(fā)電活動增多，輕收縮時顯示多相波明顯增多，電位時限縮短，波幅降低，并有病理干擾相;⑤肌肉活檢可見肌纖維腫脹或萎縮、變性，大量脂肪和結(jié)締組織增生。在獲得家系成員知情同意后，抽取外周靜脈血5 mL，置于含有ACD抗凝管中備用。隨機抽取140例家系外正常健康對照者，其中男64例，女76例，均無肌萎縮及肌無力表現(xiàn)，無肌酶改變，獲得知情同意后，抽取外周靜脈血5 mL，置于含有ACD的抗凝管中備用。

圖1 DMD家系示意圖

1.2 Dystrophin 基因檢測

1.2.1 主要儀器及試劑 臺式高速低溫離心機;水平及垂直電泳儀系列;PCR儀;MF3-11多功能三維旋混儀;UVP Bio Spectrum R600Imaging System凝膠成像儀;Tag DNA聚合酶，dNTP等。

1.2.2 模板制備與PCR擴增 用快速鹽析法提取外周血全基因組DNA，置－20℃冰箱備用。對Dystrophin基因79對引物分別進行擴增，其中第59號外顯子引物為:上游 5'CAAAGGGAGTTATCTGTGAGG 3'，下游 5'GAATTTGTGAAAGACGGACTG 3'，片段長度749 bp，PCR后用于測序和限制性核酸內(nèi)切酶處理。引物均由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物PCR反應(yīng)體系20μL，組份為:滅菌純水6μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA 模板(50～100 ng/μL)2 μL，2×Taq PCR Green Mix 10 μL。兩對引物退火溫度均為54.5℃，共36個循環(huán)。

1.2.3 DNA直接測序及限制性核酸內(nèi)切酶分析(RELP) 由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司將所需測序樣本PCR產(chǎn)物用雙脫氧末端終止測序法行DNA序列測定。限制性核酸內(nèi)切酶處理:內(nèi)切酶Msp1，切點 TC CGG，20 μL體系中，內(nèi)切酶(Msp1)0.5 ～2 μL(10 U/μL)、DNA(0.5 ～1 μg/μL)1 μL、10×Buffer Tango 2μL，37℃水浴過夜。處理后，用1.5%瓊脂糖水平跑膠，凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。

2 結(jié)果

2.1 DNA直接測序結(jié)果 先證者行Dystrophin基因所有外顯子的測序。測序結(jié)果用Chromas軟件進行BLAST分析，再將測序峰與網(wǎng)上檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)結(jié)果重新比對。先證者Dystrophin基因第9017位發(fā)生G→A的純合突變(上下為正反向測序圖)，在網(wǎng)上序列比對后得出，此為錯義變異，其所代表的精氨酸的2937位密碼子變化為谷氨酰胺(R2937Q)，見圖2。

圖2 DNA直接測序結(jié)果

2.2 RELP結(jié)果 先證者9017位位點發(fā)生純和變異，故沒有被酶切(Ⅳ1);家系內(nèi)其他成員和正常對照者9017位位點未發(fā)生變異，故被酶切成兩段(256 bp和493 bp)。

圖3 先證者及其他家系成員、健康對照者基因變異位點PRLP結(jié)果

3 討論

DMD是一種遺傳性、進行性加重的肌肉疾病，其特征為進行性近端肌肉無力，伴肌纖維的破壞與再生，被結(jié)締組織所取代［5］。DMD患者多預(yù)后不良，一般學(xué)齡期初診［6］，多因呼吸衰竭或心臟衰竭等并發(fā)癥而死亡。其遺傳特征多符合X染色體隱性遺傳，由于女性有兩條X染色體，當(dāng)隱性致病基因在雜合狀態(tài)時，隱性基因控制的性狀或遺傳病不顯示出來，此為女性表型正常的致病基因攜帶者，只有當(dāng)兩條X染色體上等位基因都是隱性致病基因純合子時才表現(xiàn)出來。而男性只有一條X染色體，Y染色體上缺少同源節(jié)段，所以只要X染色體上有一個隱性致病基因就發(fā)病［7］。

鑒于DMD明顯的遺傳特征，國內(nèi)外許多學(xué)者對此進行了研究。目前較為肯定的致病基因是Dystrophin基因，其包括79個外顯子，全長約為2 500 kb。其mRNA序列長1.4 kb，主要表達于骨骼肌、心肌，少量表達于腦組織［7～12］。Dystrophy 基因按照功能劃分可分為四部分:氨基端區(qū)域(1～8號外顯子)、中央棒狀區(qū)(9～62號外顯子)、富含半胱氨酸區(qū)域(63～69號外顯子)、羧基端區(qū)域(70～79號外顯子)。之前已知的突變類型中最為常見的為基因缺失，存在2個缺失熱區(qū)，一個位于中央?yún)^(qū)域，是最多見的缺失區(qū)域，多包括45～55號外顯子，另一個缺失熱區(qū)位于基因的5'端，多包括2～20號外顯子。有報道稱，缺失熱區(qū)中外顯子缺失斷裂點的分布在亞洲及歐洲人群中存在差異［13～16］。

鑒于人種的差異，本研究檢測了一個中國DMD家系Dystrophin基因突變類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者出現(xiàn)了一個堿基純合錯義變異，是位于第59號外顯子(c.9017G＞A)，導(dǎo)致代表精氨酸的2937位密碼子突變?yōu)楣劝滨０?p.Arg 2937Gln)，而對其家系進行檢測后，其遺傳類型并不符合X染色體隱性遺傳規(guī)律。目前該突變尚未在其他文獻及DMD數(shù)據(jù)庫中報道。進一步對正常對照者進行篩查，初步排除基因多態(tài)性的可能，因而推測此為一個堿基突變。由于此突變在此家系先證者中出現(xiàn)，故考慮此位點的堿基突變與家系DMD的致病可能有密切的關(guān)聯(lián)。Dystrophy基因第59號外顯子位于中央棒狀區(qū)，其轉(zhuǎn)錄可能會影響Dp427蛋白，后者主要表達于腦、肌肉等組織中。推測Dystrophy基因第59號外顯子中的錯義突變可能會影響上述蛋白的結(jié)構(gòu)或功能，從而導(dǎo)致一些臨床癥狀的發(fā)生。

本研究在我國DMD家系先征者中發(fā)現(xiàn)了Dystrophin基因一個新的突變位點，說明我國DMD患者可能存在與國外不同的基因突變位點。其家系遺傳可能并不符合X染色體隱性遺傳規(guī)律，故目前應(yīng)進一步進行家系研究，并對新發(fā)現(xiàn)的突變進行相關(guān)細胞生物學(xué)表達試驗。

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