李 強 姬曉旭 鐘 秋 黃新堂＊, 熊 麗＊,

(1華中師范大學納米科技研究院，武漢 430079)(2南陽師范學院物理與電子工程學院，南陽 473061)(3湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學重點實驗室，華中師范大學生命科學學院，武漢 430079)

蛋白質(zhì)分子與納米顆粒的相互作用會對納米顆粒的生物學性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。當納米顆粒接觸到生物體后，蛋白質(zhì)分子有可能在納米顆粒表面建立起動態(tài)的吸附-脫附平衡，從而形成Protein Corona[1]。研究表明Protein Corona不僅對納米顆粒的生物安全性、毒性、細胞的識別和吞噬、體內(nèi)分布等多種生物學性質(zhì)產(chǎn)生重大影響[2-4]，而且也會影響到納米顆粒在生物或醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，例如，納米顆粒用于蛋白質(zhì)分離[5-8]、蛋白質(zhì)分子對納米表面的修飾[9-15]、納米材料的制備[16-19]、蛋白質(zhì)分子與納米材料之間的電子傳遞及其在電化學傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用[20-23]以及生物分析[7,24]等多個領(lǐng)域都與納米顆粒與蛋白質(zhì)分子的相互作用性質(zhì)有關(guān)。因此，研究納米顆粒與蛋白質(zhì)分子的相互作用及其相關(guān)機理正越來越引起學者們的廣泛關(guān)注[25-31]。很多研究表明，納米顆粒主要通過納米表面與蛋白質(zhì)分子之間的作用力與蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用，例如，靜電相互作用、疏水相互作用、范德華力等[1-2]。其中靜電相互作用是納米顆粒與蛋白質(zhì)之間的一種很重要的相互作用方式。在實驗方面，ζ電勢不僅反映納米顆?；虻鞍踪|(zhì)分子的帶電狀態(tài)，而且還可以通過溶液pH值的調(diào)節(jié)來改變[32]。通過研究在不同pH值條件下納米顆粒對蛋白質(zhì)分子的吸附量及其與ζ電勢的關(guān)系，可以推斷出它們的相互作用機理。如果納米顆粒與蛋白質(zhì)分子的ζ電勢符號相反時才能觀察到蛋白質(zhì)吸附現(xiàn)象，則表明靜電相互作用是主要的作用力，否則，其他因素將起主要作用[33]。蛋白質(zhì)分子與納米顆粒的相互作用還會影響到蛋白質(zhì)的構(gòu)象以及納米顆粒的流體動力學直徑，在實驗方面可以通過FTIR光譜和DLS技術(shù)分別進行研究[1]。

作為鐵氧體類材料中的重要一員，ZnFe2O4納米材料不僅在傳感器[34-35]、光催化[36]、能源[37]等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用，而且在生物醫(yī)學領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，例如，ZnFe2O4納米顆粒用于磁共振成像[38]、生物分析[39]等。但是，ZnFe2O4納米顆粒與蛋白質(zhì)分子的相互作用性質(zhì)卻研究的較少，因而有必要考察ZnFe2O4納米顆粒與蛋白質(zhì)分子的相互作用及其機理，這將進一步促進這類材料在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究通過水熱法制備了單分散的超細ZnFe2O4納米晶(約10 nm)，并對其進行了表征。為了研究與蛋白質(zhì)分子的相互作用，以BSA和牛血紅蛋白為模式蛋白，在不同的pH條件下考察納米晶對蛋白質(zhì)的吸附性質(zhì)及其與納米晶和蛋白質(zhì)的ζ電勢之間的關(guān)系。此外，還研究了納米晶吸附蛋白質(zhì)分子后DLS粒徑的變化以及蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。為進一步揭示ZnFe2O4納米晶與蛋白質(zhì)分子相互作用機理提供必要的參考。

1 實驗部分

1.1 試 劑

實驗所用試劑FeCl3·6H2O、ZnCl2均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250，BSA和牛血紅蛋白均購自Sigma公司；實驗用水為Millipore制備的去離子水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 ZnFe2O4納米晶的制備

將 10 mmol FeCl3·6H2O 和 5 mmol ZnCl2溶解于50 mL去離子水中，在磁力攪拌的過程中用氨水調(diào)節(jié)pH值為8.0，然后裝入80 mL的高壓釜中，在190℃的溫度下水熱反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，將所得的沉淀用去離子水清洗3遍，然后在60℃烘箱中干燥以備后續(xù)實驗所用。

1.3 ZnFe2O4納米晶的表征

所得產(chǎn)物的物相結(jié)構(gòu)用PANalytical X′Pert Pro粉末X射線衍射儀進行分析。參數(shù)為Cu Kα射線λ=0.154 06 nm，掃描范圍 10°～80°，步長 0.026°。納米晶的形貌用高分辨透射電子顯微鏡JEOL JEM-2010FEF進行觀察。元素構(gòu)成通過EDX方法確定(AMETEK)。

1.4 ZnFe2O4納米晶對BSA和牛血紅蛋白的吸附實驗

以10 mmol·L-1的乙酸鈉緩沖液為溶劑，配制2 mL反應(yīng)液，其中蛋白質(zhì)(BSA或牛血紅蛋白)濃度為0.5 mg·mL-1，ZnFe2O4納米晶濃度分別為 1、2、3、4和5 mg·mL-1。為了研究pH值的影響，實驗分別在pH值為4.8、5.5、7.0和8.0的條件下進行。反應(yīng)液振蕩 2 min 后，經(jīng)過 10 000 r·min-1，3 min 的離心除去納米晶，上清液中蛋白質(zhì)濃度用Bradford方法檢測。蛋白質(zhì)的吸附率通過公式(c0-ce)/c0×100%進行計算，其中c0為蛋白質(zhì)的原始濃度，ce為反應(yīng)后的蛋白濃度。蛋白質(zhì)的吸附容量(mg蛋白質(zhì)/g納米晶)通過公式[(c0-ce)/cnano]×1 000進行計算，其中cnano為納米晶的濃度。

蛋白質(zhì)及納米晶在不同的pH條件下的ζ電勢通過Marlven zen3690儀器測量得到。為了研究蛋白質(zhì)吸附對納米晶DLS粒徑的影響，納米晶吸附蛋白質(zhì)前后的DLS粒徑同樣在Marlven zen3690儀器上測得。

1.5 FTIR光譜法分析納米晶對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響

將吸附了蛋白質(zhì)的納米晶用去離子水清洗3遍以除去緩沖液成分，然后在-60℃充分冷凍干燥以除去水分。FTIR光譜分析采用KBr壓片法，約1%的樣品與KBr混合研磨，然后壓片，在FTIR光譜儀Avatar 360上測定紅外光譜。作為對比，純的BSA、牛血紅蛋白和納米晶的FTIR光譜用同樣的方法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnFe2O4納米晶的表征

圖1c為納米晶的XRD衍射圖，可以看出所有的衍射峰對應(yīng)于尖晶石結(jié)構(gòu)的ZnFe2O4(PDF No.22-1012)，無其他雜峰出現(xiàn)。EDX結(jié)果(圖1d)表明納米晶的元素構(gòu)成為Zn、Fe和O，而且Zn與Fe的原子比為12正好符合化學式ZnFe2O4中的Zn與Fe的原子比例。圖1a顯示的是納米晶在TEM下的形貌，可以看出納米晶為球形，尺度在10 nm左右，形貌均一。在HRTEM照片(圖1b)中可以清晰的看到納米晶的晶格，經(jīng)測量晶格間距為0.300 nm正好對應(yīng)于XRD中晶面(220)的衍射峰。綜合以上的結(jié)果，本實驗制備的樣品為直徑約10 nm，尖晶石型的ZnFe2O4納米晶。

水熱法是制備鐵氧體類納米材料的有效方法，并且已經(jīng)有了比較深入的研究[40-42]。在制備時，先將氯化鐵和氯化鋅溶于水中使得Fe3+和Zn2+離子在原子層面均勻混合，然后加入堿源使金屬離子共沉淀成混合均勻的Fe(OH)3和Zn(OH)2溶膠。由于熱力學的原因，在室溫下不能生成ZnFe2O4晶相，只有在高溫水熱條件下ZnFe2O4晶相的生長才成為一個自發(fā)的過程[41]。當水熱溫度超過100℃時，開始出現(xiàn)ZnFe2O4晶相，隨著水熱反應(yīng)溫度的升高納米晶的尺度逐漸增大，反應(yīng)溫度為200℃時納米晶的尺度約為10 nm，在300℃時達到30 nm；反應(yīng)的最初2 h里，納米晶的成核與生長過程共存，2 h之后，納米晶經(jīng)歷一個Ostwald熟化過程，粒徑逐漸穩(wěn)定，不再隨著反應(yīng)時間的延長而增大[42]。本研究在190℃條件下，經(jīng)過10 h的水熱反應(yīng)制備出了約10 nm的ZnFe2O4納米晶，符合文獻報道的反應(yīng)機理。

圖1 ZnFe2O4納米晶的表征Fig.1 Characterizations of ZnFe2O4nanocrystals

2.2 ZnFe2O4納米晶對蛋白質(zhì)的吸附及其與ζ電勢的關(guān)系

圖2是納米晶在不同pH條件下對BSA和牛血紅蛋白的吸附特征。從圖2a可以看出，納米晶對BSA有很強的吸附能力，并且和pH值有關(guān)。當濃度為1 mg·mL-1而且pH為5.5的條件下，納米晶對BSA吸附率最高(76.5%)，而在pH為4.8時吸附率最低僅有36.6%。當納米晶的濃度超過2 mg·mL-1時，納米晶對BSA的吸附率在所有的pH范圍內(nèi)都能到達100%。圖2b是計算得出的BSA吸附容量與pH值之間的關(guān)系，在pH為5.5時，納米晶的吸附容量最高達到382.8 mg·g-1，而在pH為4.8時，吸附容量為199.9 mg·g-1。為了研究納米晶對蛋白質(zhì)的吸附機理，在不同pH條件下對ZnFe2O4納米晶、BSA和牛血紅蛋白的ζ電勢進行了測量(圖3)。從圖中可以看出，納米晶的ζ電勢在所有的pH范圍內(nèi)都為正，表明所帶的電荷為正電荷，而且隨pH值的變化不大。BSA的ζ電勢隨pH值的變化非常明顯，在pH=4.8時為正4.5 mV，表明帶正電荷，隨著pH值升高ζ電勢降低并且變?yōu)樨撝?。靜電相互作用是納米顆粒與蛋白質(zhì)分子之間的一種很重要的相互作用方式。由于靜電相互作用具有同性電荷排斥，異性電荷吸引的性質(zhì)，所以在理想的狀態(tài)下，只有納米顆粒與蛋白質(zhì)分子帶相反電荷時，才會出現(xiàn)納米顆粒與蛋白質(zhì)分子之間的吸附現(xiàn)象。而實驗結(jié)果表明，當納米晶與BSA所帶電荷相同時(pH=4.8)，納米晶對BSA仍然有很強的吸附。此外，當納米晶具有最高的吸附容量時(pH=5.5)，納米晶與BSA之間的ζ電勢之差卻不是最大(pH為5.5、7.0和8.0時，ζ電勢之差分別為32.1、42.8和39.3 mV)。因此靜電相互作用不能完全解釋ZnFe2O4納米晶與BSA之間的相互作用。這種違反靜電相互作用規(guī)律的吸附現(xiàn)象可能與蛋白質(zhì)分子所帶電荷的空間分布不均一性有關(guān)，也可能與疏水性相互作用有關(guān)，并且在一些文獻中已有所報道[33,43]。

圖2 ZnFe2O4納米晶在不同pH條件下對蛋白質(zhì)的吸附性質(zhì)Fig.2 Protein adsorption properties of ZnFe2O4nanocrystals at different pH values

圖2c是ZnFe2O4納米晶在不同pH條件下對牛血紅蛋白的吸附率曲線。當pH為7.0或8.0時，納米晶對牛血紅蛋白有很強的吸附能力，1 mg·mL-1濃度的納米晶能夠達到高于80%的吸附率，而在pH=4.8或5.5時，納米晶對牛血紅蛋白的吸附率卻非常低。圖2d是計算得出的吸附容量與pH值之間的關(guān)系，再結(jié)合圖3中ζ電勢的結(jié)果，可以看出，當牛血紅蛋白和納米晶的ζ電勢符號相同時 (pH=4.8或5.5)，納米晶對牛血紅蛋白的吸附容量極低，而符號相反時(pH=7.0或8.0)，吸附容量高達434.0 mg·g-1和 432.3 mg·g-1。綜合分析圖 2c、2d 和圖 3 的結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)ZnFe2O4納米晶對牛血紅蛋白的吸附與電荷的排斥或吸引規(guī)律高度相關(guān)。所以靜電相互作用是納米晶與牛血紅蛋白質(zhì)之間的主要相互作用方式。

圖3 納米晶、BSA和牛血紅蛋白在不同pH值下的ζ電勢Fig.3 ζ potentials of nanocrystals,BSA and Hemoglobin under different pH values

2.3 ZnFe2O4納米晶與蛋白質(zhì)分子相互作用的DLS分析

DLS是研究納米顆粒與蛋白質(zhì)分子相互作用的一種有效方法。當檢測激光照射到納米顆粒表面時，由于納米顆粒本身的布朗運動，會使散射光產(chǎn)生多普勒位移。通過這種多普勒位移可以得到納米顆粒的擴散系數(shù)，再通過Stokes-Einstein關(guān)系就可計算出納米顆粒的流體力學直徑；由于納米顆粒表面形成的水化層或吸附的離子層能夠影響到納米顆粒的布朗運動，所以動態(tài)光散射技術(shù)測出的粒徑往往大于納米顆粒的真實粒徑；當?shù)鞍踪|(zhì)分子接觸到納米顆粒后，蛋白質(zhì)吸附在納米顆粒表面的數(shù)量或方式將顯著改變納米顆粒的布朗運動，然后通過納米顆粒的流體力學直徑的變化反映出來[1]。圖4是ZnFe2O4納米晶吸附蛋白質(zhì)分子后DLS粒徑的變化。從圖中可以看出，BSA或牛血紅蛋白的吸附對納米晶粒徑的分布以及大小產(chǎn)生了不同的影響。未吸附蛋白質(zhì)的納米晶粒徑為僅為38.35 nm，而吸附牛血紅蛋白質(zhì)后納米晶的粒徑明顯變大并分裂成3個峰，分別位于64.95、182.7和2 692 nm。從中可以看出38.35 nm的峰消失，表明所有的納米晶都吸附了牛血紅蛋白分子。由于單個納米顆粒以及納米顆粒的二聚體、寡聚體和團聚體在DLS測量結(jié)果中會表現(xiàn)為不同的粒徑分布峰，所以通過比較不同峰的粒徑大小關(guān)系，能夠推斷出納米顆粒所處的狀態(tài)。這一原理已經(jīng)成功用于免疫分析[44]。由于64.95 nm小于38.35 nm的2倍(76.7 nm)，再考慮到蛋白質(zhì)吸附的影響，64.95 nm的峰是單個納米晶吸附牛血紅蛋白后形成的。而182.7 nm是64.95 nm的2.8倍，表明182.7 nm的峰對應(yīng)于3個納米晶吸附血紅蛋白之后形成的三聚體。2 692 nm的峰則是大量納米晶吸附蛋白后團聚而成的，但是峰的強度很弱，表明這種團聚體所占的比例很小。相比于牛血紅蛋白的情況，納米晶吸附BSA后的粒徑分布卻非常簡單，僅在927.2 nm處有一個非常強的峰。表明納米晶吸附BSA后僅以團聚體的形式存在。綜合DLS結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)ZnFe2O4納米晶吸附牛血紅蛋白后主要以單體和三聚體的形式存在，僅存在極少量的團聚體，而納米晶吸附BSA后完全以團聚體的形式存在。這種差異反映出納米晶與牛血紅蛋白和BSA相互作用方式的不同。

圖4 蛋白質(zhì)吸附對納米晶DLS粒徑的影響Fig.4 Protein adsorption effects on DLS size of nanocrystals

圖5 納米晶與蛋白質(zhì)相互作用的FTIR分析Fig.5 FTIR analysis of nanocrystal-protein interaction

2.3 ZnFe2O4納米晶與蛋白質(zhì)分子相互作用的FTIR光譜分析

FTIR光譜是研究納米材料對蛋白質(zhì)分子構(gòu)象影響的一種有效手段，具有靈敏、快速和廉價的優(yōu)點[1,45]。紅外光譜源于分子中的極性化學鍵的各種振動模式。由于這些振動模式對于化學鍵強度及鍵長的微小變化極為敏感，因此當化學鍵由于外界因素發(fā)生微小變化時，能夠通過紅外光譜靈敏的反映出來。在蛋白質(zhì)分子中相鄰極性化學鍵的振動耦合與蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，當?shù)鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，會影響到極性化學鍵的振動頻率并在紅外光譜中反映出來[45]。圖5是納米晶吸附蛋白質(zhì)分子后對蛋白質(zhì)FTIR光譜的影響。從圖中可以看出，ZnFe2O4納米晶在553 cm-1處有一個非常強的吸收峰。該峰是納米晶中金屬離子與氧離子之間的伸縮振動產(chǎn)生的，是鐵氧體材料最強的特征性吸收峰[46]。蛋白質(zhì)分子的FTIR光譜中有兩個特征性的峰分別是酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)和酰胺Ⅱ帶(1 600～1 500 cm-1)。其中酰胺Ⅰ帶源自肽鍵中羰基C=O的伸縮振動，對于蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象變化比較敏感，因此廣泛用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究。酰胺Ⅱ帶源自酰胺鍵N-H平面內(nèi)的彎曲振動和C-N平面內(nèi)的伸縮振動，但對蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化不敏感[45]。從圖5a中可以看出，純的BSA在1 650 cm-1處有一個強的吸收峰，對應(yīng)于酰胺Ⅰ帶，而1 535 cm-1則對應(yīng)于酰胺Ⅱ帶。當納米晶吸附BSA后，在紅外譜中出現(xiàn)了酰胺Ⅰ帶的峰1 651 cm-1和酰胺Ⅱ帶的峰1 536 cm-1，表明了BSA的存在，同時出現(xiàn)了ZnFe2O4的特征性吸收峰554 cm-1。對比于純BSA的紅外譜，納米晶僅導致BSA的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶增加了一個波數(shù)，表明對蛋白構(gòu)象影響不大。圖5b是納米晶對牛血紅蛋白構(gòu)象的影響。純的牛血紅蛋白的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶分別位于1 653 cm-1和1 536 cm-1，而納米晶的吸附則導致酰胺Ⅰ帶減少3個波數(shù)，酰胺Ⅱ帶增加1個波數(shù)，與圖5a相比發(fā)現(xiàn)納米晶對牛血紅蛋白的構(gòu)象影響大于對BSA構(gòu)象的影響，反映出納米晶與這兩種蛋白相互作用機理的不同。

3 結(jié) 論

水熱法制備的ZnFe2O4納米晶對BSA和牛血紅蛋白都有很強的吸附能力，但是它們的相互作用機理不同。納米晶對牛血紅蛋白的吸附符合靜電吸附的規(guī)律，但對BSA的吸附則不符合靜電吸附的規(guī)律。DLS研究顯示納米晶吸附牛血紅蛋白后主要以單體和三聚體的形式存在，僅存在極少量的團聚體，而納米晶吸附BSA后全部以團聚體的形式存在。FTIR光譜研究則表明牛血紅蛋白空間構(gòu)象更易受到納米晶的影響。ZnFe2O4納米晶在合適的pH條件下對蛋白質(zhì)的吸附容量高達380 mg·g-1以上，而且與不同蛋白質(zhì)的相互作用機理不同，具有一定的選擇性，因此在蛋白質(zhì)的高效和高選擇性分離方面可能有潛在的應(yīng)用。

致謝：文章作者感謝武漢大學電子顯微鏡中心提供高分辨率透射電子顯微鏡觀察。

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