黃 彬 陳韻聰 郭子建 何衛(wèi)江

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)

0 引 言

硫化氫是繼NO與CO之后的第三個(gè)被確認(rèn)的人體氣體信號(hào)分子，在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[1-4]。同時(shí)硫化氫還被發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)中也具有許多重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張、抗氧化、抑制發(fā)炎、降低新陳代謝速率等[5-9]。硫化氫水平異常還被認(rèn)為與阿爾茲海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等密切相關(guān)[10-13]。硫化氫的生理學(xué)和病理學(xué)功能研究已經(jīng)成為目前化學(xué)與生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，而發(fā)展準(zhǔn)確快捷的硫化氫檢測(cè)方法成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵課題之一。傳統(tǒng)H2S檢測(cè)技術(shù)包括比色法、電化學(xué)法和氣相色譜法等[14-19]。這些方法不僅需要進(jìn)行樣品預(yù)處理，而且無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞和活體中硫化氫的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，也不能提供空間分布信息。這也正是目前體內(nèi)各組織的硫化氫濃度水平存在較大爭(zhēng)議的主要原因[20-22]。

由于靈敏度高、響應(yīng)快和可實(shí)現(xiàn)生物實(shí)時(shí)造影等特點(diǎn)，熒光分析和造影已成為生物分子實(shí)時(shí)跟蹤的重要手段和研究熱點(diǎn)。近年來(lái)硫化氫熒光探針的研究逐漸引起人們的關(guān)注,已有多例硫化氫熒光探針的研究報(bào)道[23-32]。這些熒光探針有的已可用于血液中H2S的檢測(cè)或者細(xì)胞中的成像，對(duì)內(nèi)源性硫化氫檢測(cè)研究有極大的促進(jìn)作用。由于硫化氫的pKa1約為 7.04，在生理(pH 7.40)條件下硫化氫會(huì)發(fā)生脫質(zhì)子解離作用，胞內(nèi)H2S與HS-的比例約為1∶2(nH2S∶)。因此文獻(xiàn)中常以NaHS或Na2S作為H2S供體進(jìn)行探針響應(yīng)性能的研究。

硫化氫熒光探針主要有3種設(shè)計(jì)策略：1.利用硫化氫的還原性將探針的疊氮基團(tuán)還原為氨基從而改變探針分子的熒光性質(zhì)[23-24]；2.利用硫化氫的親核性通過對(duì)探針分子的親核進(jìn)攻改變探針分子的熒光性質(zhì)[25-27]；3.利用 S2-與 Cu2+極強(qiáng)的親和力(溶度積常數(shù)KSP=6×10-36)將Cu2+從與熒光配體形成的銅配合物中脫除。由于具有順磁效應(yīng)的Cu2+具有猝滅熒光的特點(diǎn)，相應(yīng)銅配合物的熒光很弱。Cu2+的脫除可以使得熒光配體的熒光得到恢復(fù)，表現(xiàn)出對(duì)硫化氫的熒光增強(qiáng)響應(yīng)[28-30]。目前大部分報(bào)道的硫化氫熒光探針采用前兩種設(shè)計(jì)策略。這兩種設(shè)計(jì)策略中使用的化學(xué)反應(yīng)大多不可逆，探針基本不能重復(fù)利用，而且多數(shù)反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間完成(10～120 min)，難以實(shí)現(xiàn)硫化氫的快速跟蹤和實(shí)時(shí)檢測(cè)。第三種設(shè)計(jì)策略有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，脫除反應(yīng)不僅響應(yīng)迅速有利于實(shí)現(xiàn)硫化氫的快速跟蹤，而且釋放出的熒光配體可與Cu2+重新結(jié)合形成配合物探針實(shí)現(xiàn)再利用。同時(shí)由于CuS的溶度積非常小，該類探針對(duì)S2-往往具有很高的靈敏度。本研究基于第三種策略設(shè)計(jì)了一個(gè)新的基于銅配合物的H2S熒光探針，其中的熒光配體1通過將4-氨基-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑 (NBD)熒光團(tuán)的4-氨基修飾為水溶性的銅離子螯合團(tuán)三乙烯四胺而獲得。采用NBD熒光團(tuán)則是因?yàn)槠淇梢姽饧ぐl(fā)性能有利于降低生物樣本檢測(cè)中的光毒性和自發(fā)熒光干擾。同時(shí)其較大的斯托克斯位移、良好的水溶性和生物相容性也有利于探針的實(shí)際應(yīng)用。熒光配體1的合成路線如圖1所示。

圖1 熒光配體1的合成路線Fig.1 Synthesis of fluorescent ligand 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

合成中所用主要試劑為南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院采購(gòu)的國(guó)產(chǎn)試劑。Boc-ON和NBD-Cl購(gòu)自Aldrich，三乙烯四胺為化工廠工業(yè)品。光譜測(cè)試中的溶劑為Aldrich光譜純?nèi)軇?，配制溶液用水為二次水，HEPES和各類無(wú)機(jī)鹽也來(lái)自Aldrich。電噴霧質(zhì)譜由LCQ電噴霧質(zhì)譜儀(ESI-MS，Thermo Finnigan)測(cè)定，同位素分布峰分析采用ISOPRO程序模擬。核磁共振譜分別在Bruker DRX-500和Bruker DRX-300核磁共振波譜儀上采集。吸收光譜用Shimadzu UV-3100分光光度計(jì)測(cè)定。熒光光譜由AMINCO Bowman series 2熒光光譜儀記錄。pH值用PHS-3精密pH計(jì)記錄。

1.2 熒光配體1的合成

100 mL三頸瓶中加入三乙烯四胺(720 mg，4.92 mmol)和25 mL THF，冰浴下攪拌滴加30 mL含Boc-ON(2.47 g,10.03 mmol)的THF溶液。1 h內(nèi)滴加完畢后室溫繼續(xù)攪拌18 h。脫去溶劑后進(jìn)行柱層析分離得淡黃色固體 2(二氯甲烷/甲醇，4∶1，V/V)，產(chǎn)量：1.18 g，產(chǎn)率：69.4%。

100 mL圓底燒瓶中分別加入化合物2(0.346 g,1.0 mmol)、NBD-Cl(0.199 g,1.0 mmol)、無(wú)水碳酸鉀和15 mL乙腈，室溫?cái)嚢? h后抽濾。濾液脫去溶劑后獲得的殘余物經(jīng)柱層析(二氯甲烷/乙酸乙酯，4∶1，V/V)后得化合物 3，產(chǎn)量：240 mg，產(chǎn)率：47.2%。

25 mL圓底燒瓶中分別加入化合物3(0.204 g，0.4 mmol)、2 mL二氯甲烷和1 mL三氟乙酸。室溫?cái)嚢? h后脫去溶劑即得熒光配體1，產(chǎn)量:112 mg，產(chǎn)率：91.2%。1H NMR(500 MHz,D2O，ppm)δ:8.37(d,J=8.5 Hz,1H),6.29 (d,J=8.5 Hz,1H),3.67(br,2H),3.08 (t,J=6.3 Hz,4H),2.96 (t,J=6.2 Hz,2H),2.89 (t,J=6.3 Hz,4H).13C NMR (125 MHz,D2O)δ:145.96,143.91,143.60,138.58,119.99,100.58,50.36,40.81,37.06.MS-ESI (positive mode,m/z):Calcd.310.15,Found 310.25 for[M+H]+.

1.3 熒光配體1的光譜測(cè)試

取化合物1的DMSO儲(chǔ)備液加入到100 mL容量瓶中，以含5%DMSO(V/V)的HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)定 容配制成濃度分別為 100 μmol·L-1和 10.0 μmol·L-1的溶液。熒光配體1的吸收光譜利用前者測(cè)定，而其Cu2+滴定吸收光譜測(cè)定是通過向3 mL上述溶液(100 μmol·L-1)中分別加入不同體積的Cu2+水溶液(12 mmol·L-1，每次 2.5 μL)充分混勻后測(cè)定。 化合物 1的熒光光譜測(cè)定利用濃度為10.0 μmol·L-1的溶液測(cè)試完成，其Cu2+熒光滴定光譜則是通過向3 mL溶液中分別加入不同體積的Cu2+水溶液(1.2 mmol·L-1，每次加2.5 μL)后進(jìn)行測(cè)定的。

1.4 熒光配體1對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)測(cè)試

化合物1對(duì)金屬離子的熒光選擇性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)在含 5%DMSO(V/V)的 HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中進(jìn)行。 在向3 mL 化合物 1 溶液(10.0 μmol·L-1)中加入 2.5 μL 金屬離子水溶液充分混勻后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。測(cè)定堿金屬或堿土金屬離子響應(yīng)時(shí)溶液中被測(cè)金屬總濃度為化合物1濃度的1 000倍。測(cè)定其他金屬離子響應(yīng)時(shí)被測(cè)金屬離子的總濃度與化合物1濃度相等。

1.5 配合物1-Cu2+的S2-熒光滴定

實(shí)驗(yàn)同樣在前述含5%DMSO的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行。配合物探針1-Cu2+通過加入等當(dāng)量的熒光配體1和Cu2+形成。滴定通過逐漸向3 mL 1-Cu2+配合物溶液(10.0 μmol·L-1)中加入不同體積的Na2S水溶液(1.2 mmol·L-1，每次加 2.5 μL)進(jìn)行，光譜測(cè)定均在充分混勻后完成。

1.6 配合物1-Cu2+的陰離子熒光選擇性響應(yīng)測(cè)試

配合物探針1-Cu2+對(duì)陰離子的選擇性響應(yīng)能力及S2-與其他陰離子的競(jìng)爭(zhēng)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)也在前述的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行。選擇性實(shí)驗(yàn)中向3 mL配合物 1-Cu2+(10.0 μmol·L-1)溶液中分別加入 12.5 μL濃度為 12 mmol·L-1硫化鈉水溶液(5 equiv)或12.5 μL濃度為480 mmol·L-1的其他陰離子 (100 equiv)溶液，充分混勻后分別進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中則在加入12.5 μL濃度為480 mmol·L-1的競(jìng)爭(zhēng)陰離子溶液后繼續(xù)加入12.5 μL濃度為12 mmol·L-1硫化鈉水溶液，充分混合后進(jìn)行測(cè)定。

1.7 探針1-Cu2+的線性響應(yīng)范圍及檢測(cè)限測(cè)定

測(cè)試在含 10 μmol·L-11-Cu2+配合物的前述緩沖溶液中進(jìn)行。向3 mL探針溶液中分別加入不同體積的 Na2S 水溶液(1.2 mmol·L-1)，每次加 2.5 μL，充分混勻后進(jìn)行熒光測(cè)試。檢測(cè)限測(cè)試先掃描背景20遍，獲得標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，再根據(jù)線性范圍內(nèi)的斜率(S)利用3σ/S求出檢測(cè)限。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光配體1的Cu2+紫外滴定研究

自由熒光配體1的最大吸收峰出現(xiàn)在478 nm，相對(duì)摩爾吸光系數(shù)為 1.7×104L·mol-1·cm-1(圖 2)。 隨著Cu2+的加入，該吸收峰逐漸降低并發(fā)生藍(lán)移，同時(shí)在400 nm處的吸收逐漸增強(qiáng)。滴定光譜在455、350及310 nm處有3個(gè)清晰的等吸收點(diǎn)，表明化合物1與Cu2+發(fā)生了配位作用形成了穩(wěn)定的配合物。從根據(jù)478和400 nm處的吸收強(qiáng)度繪制的滴定曲線可以看出熒光配體1的吸收隨著加入Cu2+總濃度發(fā)生線性變化。在加入1倍的Cu2+后繼續(xù)滴加Cu2+吸收光譜趨于穩(wěn)定。這些結(jié)果表明化合物1與Cu2+是以1∶1方式配位結(jié)合的。根據(jù)NBD類熒光分子的相關(guān)報(bào)道可推測(cè)478 nm處的吸收峰為NBD的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)吸收峰[33-34]，而當(dāng)4-氨基參與配位后ICT效應(yīng)減弱并導(dǎo)致吸收峰發(fā)生藍(lán)移。

圖2 熒光配體 1(100 μmol·L-1)在含 5%DMSO(V/V)的HEPES 緩沖溶液(50mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中的Cu2+紫外滴定光譜圖Fig.2 Absorption spectra of compound 1(100 μmol·L-1)obtained upon Cu2+titration in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)

2.2 熒光配體1的Cu2+熒光滴定研究

圖3 熒光配體 1(10 μmol·L-1)在含 5%DMSO(V/V)的HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH7.20)中的 Cu2+熒光滴定光譜圖Fig.3 Emission spectra of compound 1(10 μmol·L-1)obtained in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)upon Cu2+titration

熒光光譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)自由熒光配體1的最大激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為548 nm，斯托克斯位移將近80 nm，有利于降低熒光檢測(cè)中激發(fā)的干擾，達(dá)到設(shè)計(jì)目的。從Cu2+熒光滴定結(jié)果可以看出(圖3)，化合物1的熒光強(qiáng)度隨著Cu2+濃度的增加線性降低，而發(fā)射波長(zhǎng)并沒有移動(dòng)。當(dāng)加入Cu2+的量達(dá)到1當(dāng)量后繼續(xù)滴加則熒光光譜變化很小，也再次證實(shí)了化合物1與Cu2+的1∶1配位方式。Cu2+滴定導(dǎo)致的熒光顯著降低的原因是順磁性Cu2+配位后引起化合物1的熒光發(fā)生顯著猝滅，這也是順磁性金屬離子的一個(gè)重要特性。Cu2+這種對(duì)配體熒光的顯著猝滅作用為發(fā)展基于銅配合物Cu2+脫除的S2-增強(qiáng)響應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 熒光配體1對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)

熒光配體1(10 μmol·L-1)對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)行為同樣在前述HEPES緩沖中測(cè)定 (圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有Cu2+造成顯著的熒光猝滅，等當(dāng)量Cu2+可導(dǎo)致近90%的熒光猝滅。其他金屬離子對(duì)化合物1的熒光影響不大，Hg2+雖然也造成一定的熒光猝滅，但猝滅效應(yīng)明顯小于Cu2+。由于Cu2+配位導(dǎo)致該熒光配體的熒光猝滅效應(yīng)最強(qiáng)，相應(yīng)配合物在金屬離子脫除過程中顯示的熒光增強(qiáng)效應(yīng)將會(huì)更加顯著，因此化合物1的銅配合物更具有作為熒光增強(qiáng)型硫化氫探針的潛力。

圖4 不同金屬離子對(duì)含5%DMSO(V/V)的HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH7.20)中熒光配體 1(10 μmol·L-1)在 548 nm處熒光的猝滅效應(yīng)(λex=470 nm)Fig.4 Emission decreasing factor at 548 nm of compound 1(10 μmol·L-1)induced by different metal cations in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)(λex=470 nm)

2.4 配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫熒光響應(yīng)研究

圖5 含 5%DMSO(V/V)的 HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中配合物 1-Cu2+(10 μmol·L-1)對(duì)硫化氫的熒光響應(yīng)Fig.5 Emission spectra of complex 1-Cu2+(10 μmol·L-1)obtained upon S2-titration in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO

配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫熒光響應(yīng)研究同樣在前述含5%DMSO的HEPES緩沖溶液中完成(圖5)，實(shí)驗(yàn)中采用Na2S作為硫化氫供體，配合物通過加入等當(dāng)量的熒光配體和銅離子現(xiàn)場(chǎng)形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著加入S2-濃度的增加體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，熒光增強(qiáng)可達(dá)8倍以上。這表明S2-確實(shí)能將配合物體系中的Cu2+奪去并逐步恢復(fù)熒光配體1的熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)S2-的增強(qiáng)響應(yīng)。同時(shí)滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光增強(qiáng)響應(yīng)幾乎在硫化鈉滴加的瞬間完成，表明這一探針對(duì)硫化氫的響應(yīng)速度非常快，可以滿足硫化氫動(dòng)態(tài)跟蹤的需要，也完全符合前述配合物脫除銅離子的響應(yīng)機(jī)制。從相應(yīng)的熒光響應(yīng)照片(圖6)可以看出在紫外光照射下1-Cu2+配合物溶液幾乎沒有熒光，而當(dāng)5當(dāng)量的Na2S加入之后溶液瞬間發(fā)出黃色熒光，而且與化合物1在紫外燈照射下發(fā)出的熒光一致，顯示化合物1的熒光在硫化鈉加入后得到恢復(fù)。這一現(xiàn)象也表明配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫的熒光識(shí)別非常靈敏可靠，可以通過肉眼觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)。由熒光滴定曲線可以看出配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫的線性響應(yīng)范圍為 1～20 μmol·L-1。 根據(jù) 1.7 所述實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法確定配合物探針對(duì)硫化氫的檢測(cè)低限為0.2 μmol·L-1，而文獻(xiàn)中目前報(bào)道的絕大多數(shù)探針檢測(cè)限在1 μmol·L-1以上[32]，這也表明配合物 1-Cu2+體系具有較高的靈敏度。將熒光得到恢復(fù)的溶液再加入Cu2+，熒光再度發(fā)生類似于圖3中出現(xiàn)的猝滅現(xiàn)象，說明本體系可以用于重復(fù)檢測(cè)H2S。

圖6 紫外燈照射下配合物1-Cu2+(10 μmol·L-1)在含5%DMSO(V/V)的 HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1 HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中對(duì) Na2S的熒光響應(yīng)照片F(xiàn)ig.6 Photograph of complex 1-Cu2+(10 μmol·L-1)in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO under the irradiation with UV lamp of 365 nm

圖7 10 μmol·L-1配合物 1-Cu2+在含 5%DMSO(V/V)的 HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中對(duì)不同陰離子的熒光響應(yīng)(a)及由不同陰離子引發(fā)的548 nm處熒光增強(qiáng)比例柱狀圖(b)Fig.7 (a)Emission spectra of 10 μmol·L-1complex 1-Cu2+obtained in the presence of 5 equiv S2-or 100 equiv other anions in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO.(b)Histogram of F/F0at 548 nm of 1-Cu2+in the presence of different anions

2.5 配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫熒光響應(yīng)的選擇性

為明確配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫熒光識(shí)別的選擇性，研究還在前述HEPES緩沖溶液中測(cè)定了其他陰離子存在下該配合物的熒光光譜。測(cè)定中探針濃度為 10 μmol·L-1，S2-濃度為 50 μmol·L-1，其他陰離子濃度為 1 000 μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖 7)，配合物1-Cu2+溶液加入 100倍其他陰離子如 Ac-、SO42-、HSO42-、F-、Cl-、Br-、I-、HCO32-、CO32-、HPO42-、 H2PO4-、NO2-、SCN-、HSO32-、SO32-、S2O32-、S2O42-時(shí)熒光強(qiáng)度變化很小。相反加入5當(dāng)量的S2-可使探針體系的熒光顯著增強(qiáng)8倍以上。同時(shí)即使在高濃度的其他陰離子存在下，配合物1-Cu2+對(duì)硫化氫的增強(qiáng)響應(yīng)也不受明顯影響。這些結(jié)果表明配合物探針1-Cu2+對(duì)硫化氫的增強(qiáng)響應(yīng)具有很好的選擇性，大濃度其他常見陰離子的存在不會(huì)干擾對(duì)硫化氫的檢測(cè)。這也為該探針的生物檢測(cè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)的基于NBD熒光團(tuán)的熒光配體1能與Cu2+形成1∶1的配合物1-Cu2+，并使其熒光顯著猝滅。配合物1-Cu2+能選擇性地對(duì)硫化氫表現(xiàn)出8倍以上的熒光增強(qiáng)響應(yīng)。熒光響應(yīng)機(jī)理是S2-與Cu2+結(jié)合將Cu2+從配合物中有效脫除進(jìn)而解除了Cu2+對(duì)熒光配體的熒光猝滅效應(yīng)，導(dǎo)致配體熒光恢復(fù)增強(qiáng)。該體系具有響應(yīng)迅速、可重復(fù)利用的特點(diǎn)，靈敏度也高于大部分目前報(bào)道的硫化氫探針。探針的可見光激發(fā)特點(diǎn)及良好的硫化氫響應(yīng)性能使得該體系在檢測(cè)生物樣品中的硫化氫方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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