劉元媛，胡佳，何濤

(1.遼寧醫(yī)學院;2.錦州市藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

抗感顆粒為中國藥典收錄的成方制劑，具有清熱解毒功效，用于治療外感風熱引起的感冒，癥見發(fā)熱、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽痛、全身乏力、酸痛［1］，是治療感冒的常用中成藥之一。2010 版中國藥典對方中的芍藥苷進行了含量測定［1］759－760，鑒于目前單一成分對中成藥質量控制的局限性以及中成藥多成分的復雜性，復方制劑的質量控制已經廣泛的引入了指紋圖譜研究方法［2－3］，為提高該方的質量標準，更全面的控制制劑質量，本試驗探索了采用HPLC 法建立制劑的指紋圖譜［4－8］，該方法準確可靠，為全面控制抗感顆粒質量提供依據。

1 儀器與試藥

HITACHI 高效液相色譜儀;L－2100 高壓輸液泵;L－2450 二級管陣列檢測器;芍藥苷對照品(CAS 號23180－57－6)購自國家標準物質網，純度 ＞98%;綠原酸對照品(批號 110753－200413)購自中國藥品生物制品檢定所;超聲波清洗器;FA2004N 電子分析天平;甲醇為色譜純，水為雙蒸水;其它試劑均為分析純;10 批抗感顆粒樣品依據藥典方法自行制備(批號為110501、110502、 110503、 110504、 110505、 110506、110507、110508、110509、110510)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil (ODS 5 μm，4.6 × 200 mm);流動相系統(tǒng):甲醇 (A)—水(B)，梯度洗脫程序為:0～20 min 甲醇由25%升到35%，20～30 min 甲醇由35%升到45%，30～45 min 甲醇由45%升到80%，45～60 min 甲醇由80%升到90%;流速1.0 mL/min;檢測波長240 nm;柱溫25 ℃，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含0.407 mg 的溶液，即得。取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含0.146 mg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取抗感顆粒粉末約1 g研細，加甲醇50 mL，密塞稱定重量，超聲15 min，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，濾過，即得。

2.4 陰性液的制備 按照處方工藝，分別制備缺金銀花、缺赤芍、缺綿馬貫眾的樣品，并按照供試品溶液的制備方法處理樣品，得到金銀花陰性液、赤芍陰性液及綿馬貫眾陰性液。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按照擬定的色譜條件連續(xù)進樣5 次，結果顯示19 個共有峰的相對保留時間RSD ＜3%，相對峰面積的RSD ＜5%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8 h 進樣5 次。結果顯示19 個共有峰的相對保留時間RSD ＜3%，相對峰面積的RSD ＜5%，表明在8 h 內供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批抗感顆粒樣品5 份，按供試品溶液的制備方法操作，分別取各供試品溶液10 μL，按擬定的色譜條件進樣分析，結果顯示19 個共有峰相對保留時間的RSD ＜3%，相對峰面積RSD ＜5%，表明重復性良好。

2.6 樣品的測定 取10 批抗感顆粒樣品，按供試品溶液制備方法操作，精密吸取各對照品溶液及供試品溶液10 μL 進樣分析。

2.7 指紋圖譜的建立與分析

2.7.1 共有峰的確定 本試驗共測定了10 批抗感顆粒樣品色譜圖，結果顯示各批樣品均具有19 個特征峰，通過紫外光譜檢測各峰一致，因此選擇這19 個特征峰作為共有峰。同時通過對照品定位及紫外光譜檢測，鑒定了兩個共有峰，分別為4 號峰(綠原酸)和6 號峰(芍藥苷)，并以6 號峰為參照峰計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積，結果見表1。

表1 10批抗感顆粒指紋圖譜中共有峰的相對面積

2.7.2 峰位歸屬 采用與對照品定位對照及紫外光譜分析，鑒定了2 個主要特征峰，其中峰4 為綠原酸，來源于金銀花，結果見圖1;峰6 為芍藥苷，來源于赤芍，結果見圖2。樣品的陰性試驗表明陰性液無干擾，結果見圖3、4、5。通過將抗感顆粒制劑圖譜與各單味藥材圖譜定位對照分析顯示，峰2、3、4、5、7、8、13 歸屬金銀花;峰1、6、11 歸屬赤芍;峰15 歸屬綿馬貫眾;峰9、10、16、17、18、19 為三味藥材共有，產生2 個新的特征峰為峰12、14，結果見圖6。

2.7.3 特征指紋峰的相似度計算與分析 采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A 版)，得到10 批抗感顆粒的指紋圖譜共有模式，結果見圖7，計算10 批樣品的相似度均大于0.9，結果見表2。

表2 10批抗感顆粒HPLC 指紋圖譜相似度結果

3 討 論

3.1 本試驗考察了以甲醇－0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液［9］、乙腈－0.4% 磷酸溶液［10］、甲醇－水［11］、乙腈－水系統(tǒng)為流動相進行梯度洗脫，結果以甲醇－水系統(tǒng)的洗脫效果較好，且方法簡便易行。采用二極管陣列檢測器進行了紫外掃描檢測，比較了235、240、327、365 nm 波長下的色譜圖，結果供試品在240 nm 檢測波長下得到的色譜圖檢出峰數較多、分離效果良好，故選擇240 nm 作為檢測波長?？疾炝艘运⒓状紴樘崛∪苊?，以超聲、回流為提取方法［11］3820－3821，通過提取后的含量比較，確定了采用甲醇為溶媒，超聲提取的方法制備樣品。

3.2 通過對全方及單味藥材的色譜圖對比分析表明，全方的特征峰主要來自金銀花和赤芍，綿馬貫眾所含成分在檢測條件下較少;并發(fā)現有兩個新成分生成，可能為藥材煎煮過程中產生的新物質，具體鑒定有待進一步研究。

3.3 本試驗分析了10 批抗感顆粒的HPLC 指紋圖譜，結果表明不同批次間均具有19 個特征峰，峰面積的相對含量相差不大，且總共有峰含量在85%以上，可以較全面的體現全方的特征;鑒定了綠原酸和芍藥苷兩個特征峰，并可以同時對其定量分析。本方法操作簡單，重現性好，適合于對抗感顆粒的質量控制。

圖1 綠原酸對照品

圖2 芍藥苷對照品

圖3 金銀花陰性液

圖4 赤芍陰性液

圖5 綿馬貫眾陰性液

圖6 抗感顆粒與單味藥材的HPLC 指紋圖譜

圖7 10批抗感顆粒指紋圖譜共有模式圖

［1］中國藥典2010 年版一部［S］.2010:759－760.

［2］魏剛，劉翠玲，黃月純，等.雙柏散的HPLC 指紋圖譜研究［J］.中成藥，2010，32 (3):359－362.

［3］馬蘭，杜同仿，魏剛，等.肝脂消湯劑的HPLC 指紋圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21 (1):47－50.

［4］劉東輝，劉翠玲，黃月純，等.薄荷藥材HPLC 特征圖譜分析方法研究［J］.藥物分析雜志，2010，30 (8):1507－1509.

［5］劉翠玲，魏剛，劉東輝，等.側柏葉HPLC 指紋圖譜的方法學研究［J］.中成藥，2010，32 (8):1281－1283.

［6］李曉亮，易進海，劉云華，等.南五味子、五味子HPLC指紋圖譜研究和木脂素成分測定［J］.中成藥，2011，33(6):920－924.

［7］劉翠玲，劉東輝，黃月純，等.大黃飲片HPLC 指紋圖譜的方法學研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20 (5):442－445.

［8］鄧亞利，孫冬梅.木芙蓉藥材HPLC 指紋圖譜的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17 (6):102－105.

［9］中國藥典一部［S］.2010:147－148.

［10］中國藥典一部［S］.2010:205－206.

［11］劉元媛，盧靜華，郭偉英，等.RP－HPLC 法測定抗感顆粒中芍藥苷和綠原酸的含量［J］.中國藥房，2011，22(40):3820－3821.