李鴻儒，趙 貝，杜鋼軍，劉偉杰，李佳桓，王瑩瑩

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004）

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelidebx.）子根的加工品。其性大熱，味辛、甘，有毒，入心、脾、腎，通行十二經(jīng)，具有回陽救逆、溫里助陽、祛寒止痛的功效。用于亡陽虛脫、肢冷脈微、陽痿、宮冷、心腹冷痛等癥，被稱為“回陽救逆第一品”。白附子的藥理學(xué)作用主要有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、止痛，并對多種惡性腫瘤具有一定的抑瘤效果［1－5］。為指導(dǎo)臨床正確使用附子治療腫瘤，我們對附子藥酒的抗腫瘤作用做了初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物與瘤株

動物：健康昆明小鼠，雌性，22～25g，河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；瘤株：H22肝癌，河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)室昆明小鼠腹水傳代保存；小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞，河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)提供。

1.2 藥品

附子藥酒的制備：取附子與黃酒按1∶10的比例浸泡1周。紗布過濾濾液，供實(shí)驗(yàn)動物使用；無菌過濾濾液，供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 試劑

CK 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CAT試劑盒（南京建成生物工程研究所）；T－SOD 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（索萊寶科技有限公司）；D－h(huán)anks緩沖液（上海西唐生物科技有限公司）；MTT（上海秉東實(shí)業(yè)有限公司）；DMSO（淄博榮悅進(jìn)出口有限公司）。

1.4 儀器

HDL潔凈臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；快速混勻器SK－1（常州國華電器有限公司）；ElX 800酶標(biāo)儀（美國BIO－IEK）；TDL－508臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LDZX－75KBS立式壓力蒸氣滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；CHA－S恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；LGR16－W 高速冷凍離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；倒置生物顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；DYY－7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對小鼠肝癌皮下移植腫瘤的影響

取生長良好的腹水型肝癌昆明小鼠處死，取腹水，加無菌生理鹽水稀釋至原腹水的6至8倍，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)／mL的稀釋液，于狀態(tài)良好的小鼠前肢右腋皮下接種0.2mL／只。將接種后的小鼠按體質(zhì)量平均分為2組，即模型組和附子組，每組10只。模型組灌胃黃酒0.2mL／10g；附子組灌胃附子藥酒浸出物0.2mL／10g。2組均為腫瘤接種后即日開始給藥，每天早晚2次，灌胃2周。治療期間1次／d監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，待腫瘤長出后，用游標(biāo)卡尺隔天測腫瘤長度和寬度1 次。腫瘤大小按下列公式計(jì)算：腫瘤體積（mm3）＝（腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度）／2。

全程治療結(jié)束后次日處死小鼠，眼球取血，剝離腋部腫瘤、肝臟、脾臟、胸腺，稱重、計(jì)算腫瘤抑制率及肝臟、胸腺、脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)（mg／g）＝內(nèi)臟器官質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；腫瘤抑瘤率（%）＝（1－T／C）×100%。

式中：C為模型組，平均瘤重（g）；T為附子組，平均瘤重（g）。

2.2 對荷瘤小鼠血清中CAT、CK、T－SOD 活力的影響

小鼠接種、分組及給藥方案同“2.1”。全程治療結(jié)束后次日小鼠眶靜脈取血，分離血清，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 對血清中CAT 活力的影響 CAT 分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405nm 處測定其生成量，可計(jì)算出CAT的活力。

血清中CAT 活力（U／mL）＝（對照管OD 值－測定管OD 值）×271×1／（60×取樣量）×樣本測試前稀釋倍數(shù)。式中，取樣量為20μL。

2.2.2 對血清中CK 活力的影響 CK 催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快全部水解為磷酸。此時(shí)三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍穩(wěn)定，加入鉬酸銨可生成磷鉬酸，可進(jìn)一步還原成鉬藍(lán)，根據(jù)生成無機(jī)磷的量可算出酶的活性。

CK 活力（U／mL）＝根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的CK 酶活力×樣本測定前稀釋倍數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝7.4491 X－0.0716，其中X為測定管OD－空白管OD。

2.2.3 對血清中T－SOD 活力的影響 采用黃嘌呤氧化酶法測定T－SOD 活力的原理，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用酶標(biāo)儀測OD 值。

總SOD 活力（U／mL）＝［（對照管吸光度－測定管吸光度）／對照管吸光度］÷50%×反應(yīng)系數(shù)的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

2.3 對基質(zhì)金屬酶譜的影響

將剝離的瘤組織進(jìn)行蛋白提取，用提取的蛋白進(jìn)行明膠酶譜法電泳實(shí)驗(yàn)。酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺（SDS－PAGE，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的明膠）電泳分離，然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2）和MMP－9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色。在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP－2和MMP－9活性成正比。復(fù)性原理：在電泳過程中，SDS與樣品中的MMPs結(jié)合（可逆性結(jié)合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用。將膠置于TritionX－100中洗脫，SDS 被TritionX－100結(jié)合而去除，從而使MMPs恢復(fù)了活性。

2.4 體外實(shí)驗(yàn)

2.4.1 對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 將小鼠處死，剖腹取脾臟，于培養(yǎng)皿內(nèi)加D－h(huán)anks液，將其研磨制成單細(xì)胞懸液。Tris－NH4CL 5mL溶液溶解紅細(xì)胞后，用DMEM 完全培養(yǎng)液配制成細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)／mL的懸液，移液器于48孔培養(yǎng)板內(nèi)點(diǎn)6孔作為無ConA的模型組，250μL／孔。在細(xì)胞懸液中加入1.42mL ConA（0.2g／L），充分混勻后點(diǎn)板，每孔250μL，其中6孔作為有ConA的模型組。將藥物稀釋成4個(gè)濃度，由低到高分別為1.25×10－4、2.5×10－4、5×10－4、1.0×10－3mg／μL，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行孔，250μL／孔。2 組對照孔中加DMEM 培養(yǎng)基250μL／孔。將48孔板放入CO2培養(yǎng)箱（37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2）中培養(yǎng)48 h，加入 MTT 250μL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄MTT，加入DMSO 250μL／孔，混勻，轉(zhuǎn)移至96孔板中，在570nm 處用酶標(biāo)儀測OD 值。

2.4.2 對小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞增殖的影響 取4T1小鼠乳腺癌傳代細(xì)胞，加3 mL 胰酶消化，振蕩搖勻，加入2mL培養(yǎng)基以中和胰酶，離心2次，棄去上清液，加入培養(yǎng)基吹打均勻，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，吹打成單細(xì)胞懸液，備用。上述細(xì)胞點(diǎn)入96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。另設(shè)置空白模型組及4個(gè)濃度梯度給藥組（藥物用培養(yǎng)基稀釋），每組設(shè)置4個(gè)平行對照孔，分別加入空白培養(yǎng)基100μL，100倍、200倍、400倍、800 倍稀釋藥物100μL。置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃條件下培養(yǎng)48h，加入MTT 5g／L，100μL／孔，放置4h，甩出96孔板中溶液，加入DMSO 100μL／孔，混勻。酶標(biāo)儀于570nm 測OD 值。

抑制率（%）＝（不加藥組OD 值－ 加藥組OD值）／不加藥組OD 值×100%。

2.4.3 檢測 用酶標(biāo)儀在570nm 處測量各孔的吸光度，計(jì)算抑制率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 對荷瘤肝癌小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

與模型組比較，給藥組瘤質(zhì)量、胸腺、脾臟指數(shù)均減小，見表1、表2；瘤體積減小，見表1；小鼠生長狀態(tài)良好。附子對小鼠肝癌有一定的抑制作用，抑瘤率為15.65%，P＜0.05。

4.2 對荷瘤小鼠的CAT、CK、SOD的影響

與模型組比較，附子組小鼠的CAT 活力顯著性增大（P＜0.01），T－SOD的活力亦增大，CK的活力顯著性減小（P＜0.01），見表3。

表1 附子對H22肝癌荷瘤小鼠瘤體積的影響（，n＝10）

表2 附子對H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤質(zhì)量的影響（，n＝10）

表3 附子對荷瘤小鼠CAT、CK、SOD的影響（，n＝10）

4.3 對小鼠脾細(xì)胞、4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

與有ConA的模型組比較，不同濃度的附子對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖無影響，見表4；對4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞無影響，見表5。

表4 附子對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

表5 附子對4T1乳腺癌細(xì)胞的抑制率

4.4 對基質(zhì)金屬酶譜的影響

與模型組比較，附子組H22肝癌瘤蛋白在72KDa處的電泳條帶比較窄，約為模型組的1／3，亮度也比較暗；在92KDa處的電泳條帶寬窄、亮度無明顯差異，見圖1。

圖1 明膠酶譜電泳圖

5 討論

近代藥理研究表明，附子具有強(qiáng)心、抗心律失常、抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等藥理活性，其中二萜生物堿類成分被認(rèn)為是特征性的活性成分［6－7］。實(shí)驗(yàn)的抑瘤率為15.65%，顯示附子對腫瘤的生長有一定的抑制作用。

免疫系統(tǒng)功能正常與否與腫瘤治療成敗有著重要的關(guān)系，免疫治療本身也是現(xiàn)代腫瘤治療的一個(gè)重要組成部分。實(shí)驗(yàn)中，附子組的胸腺及脾臟指數(shù)均降低，附子對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖無影響，提示附子的抗腫瘤作用可能不是直接的。

自由基的誘癌、促癌及致癌作用已被公認(rèn)，其產(chǎn)生和消除失衡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。CAT、T－SOD 屬于體內(nèi)消除自由基的酶類，它們與體內(nèi)其他酶類及抗氧化劑組成一個(gè)自由基的防御系統(tǒng)，以清除過多的自由基［8］。H2O2可引發(fā)細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，不僅破壞細(xì)胞膜，還能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促使DNA 鏈斷裂，從而損傷細(xì)胞，參與多種病理機(jī)制［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，附子能顯著提高CAT的活力，對T－SOD的活力亦有增強(qiáng)作用，降低體內(nèi)H2O2及超氧陰離子自由基的含量，表現(xiàn)出抗氧化、抗自由基作用，這可能是附子抗腫瘤的機(jī)制之一。

惡性腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的過程伴有細(xì)胞外基質(zhì)（ECM ）的降解，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprote inase，MMP）是引起ECM 降解的主要酶類之一，特別是與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)［10－11］。明膠酶（gelatinase）又稱Ⅳ型膠原酶，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一個(gè)重要成員，包括相對分子質(zhì)量為72000的明膠酶A （MMP－2）和相對分子質(zhì)量為92000的明膠酶B（MMP－9）。明膠酶不但能降解ECM 成分，還能降解基底膜（basementmember，BM）的主要成分Ⅳ型膠原，而癌細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移必須首先穿過BM［12－13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，附子能使MMP－2的表達(dá)顯著性增強(qiáng)，可能是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因。

綜上所述，附子有一定的抗腫瘤作用，可以使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。其機(jī)制主要與抗氧化有關(guān)，是否對部分腫瘤可表現(xiàn)為直接抑制作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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