賈彩云，王艷鴿，呼文亮，馬遠方

（1.河南大學(xué) 免疫學(xué)研究所，河南 開封 475004；2.武警醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，天津 300612）

近年來研究［1］發(fā)現(xiàn)，含有蟾蜍毒素成分的中藥復(fù)合制劑在體外能抑制多種腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)白血病的分化。臨床觀察提示，含蟾蜍毒素的中藥制劑對肝癌、肺癌、食管癌、直腸癌及白血病等有明顯的抑制作用。Numazawa等［2］研究表明，蟾蜍毒素的各種成分以劑量依賴誘導(dǎo)白血病K562細胞分化。在所有的蟾蜍毒素中，蟾蜍靈是誘導(dǎo)白血病細胞分化最有效的成分。蟾蜍靈在較低濃度（1×10－8～1×10－9mol／L）能夠在較寬的范圍內(nèi)（有較寬的白血病譜）引起人白血病的分化［3］，在較高的濃度（≥1×10－7mol／L）誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡［3］。我們的實驗以蟾蜍靈單體作用K562細胞株，研究其抑制白血病細胞生長和凋亡作用。

1 資料和方法

1.1 試劑

蟾蜍靈購自天津藥物研究所，用無水乙醇配成1mol／L的貯存液，使用前用完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度；四甲基偶氮唑藍（MTT）為美國sigma公司產(chǎn)品；TUNEL（末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法）凋亡試劑盒為德國Roche 公司產(chǎn)品；Trizol為美國Gibco BRL 公司產(chǎn)品；RT－PCR 試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞株和細胞培養(yǎng)

K562（人髓性白血病細胞株）細胞由天津市血液病研究院惠贈。K562 細胞用內(nèi)含體積分數(shù)為10%的滅活胎牛血清、80U／mL的慶大霉素、20mmol／L HEPEs、質(zhì)量分數(shù)為0.2% NaHCO3、質(zhì)量分數(shù)為0.01%L－谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 倒置光顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)變化

分別計數(shù)不同時間點對照組和處理組（1.00μmol／L）活細胞數(shù)，每個時間點每組細胞各計數(shù)3次，取其平均值。

1.4 熒光顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)變化

分別收集對照組和處理組細胞2×106個，PBS磷酸鹽緩沖液重懸，加入Hoechst 33342／PI（1∶1）的染液，37℃孵育8min，離心，棄上清，PBS磷酸鹽緩沖液50μL重懸，涂片，熒光顯微鏡下觀察、記錄并照相。正常細胞、凋亡細胞著色為藍色，死亡細胞著色為紅色。細胞記數(shù)依據(jù)上述特點，取連續(xù)4個視野，每個視野細胞記數(shù)不少于80個。

1.5 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

收集對照組和處理組（1.00μmol／L）K562細胞2×106個，用預(yù)冷體積分數(shù)為2%的戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.3）先固定12h，質(zhì)量分數(shù)為1%的鋨酸后固定2h。乙醇逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾－檸檬酸鉛雙染，在透射電鏡下觀察并攝像記錄。

1.6 MTT 實驗

取對數(shù)增長期細胞，稀釋至1×105／mL，接種96孔板，每孔0.1mL，24h后加入不同濃度的蟾蜍靈，以未經(jīng)蟾蜍靈作用K562細胞和單純的培養(yǎng)液作為陰性對照。每種濃度8個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h，加入MTT（5g／L），繼續(xù)培養(yǎng)4～5h，離心，棄上清，加入DMSO，避光震蕩約10min。用自動酶標檢測儀在570nm 處檢測96孔板的光吸收值（A570值）。細胞增殖抑制率（%）＝（A陰性對照－A實驗組）／（A陰性對照－A空白對照）×100%。

1.7 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 片段

用抽提的方法分別提取處理組及對照組K562細胞的DNA，10g／L 瓊脂糖凝膠電泳3～4h，電壓75V，紫外燈下觀察并照相。

1.8 細胞周期分析

體積分數(shù)為75% 預(yù)冷乙醇固定K562 細胞5×106個，加入PI，避光染色30min，流式細胞儀測定細胞周期，用SSC和FSC 兩個參數(shù)選取細胞，用PI熒光強度測定DNA 含量，分析G1期、S期、G2期細胞的比例以及亞二倍體峰的DNA的含量。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)輸入Excel進行管理，采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。MTT 實驗各組間的差異采用方差分析（Post－Hoc LSD 法），組間凋亡率的差異采用卡方檢驗，取P＜0.05作為顯著性差異的界值。

2 結(jié)果

2.1 倒置光顯微鏡下細胞的形態(tài)學(xué)變化

倒置光顯微鏡下，對照組K562細胞呈懸浮性生長，圓形，透明，折光性好，大小均一，形態(tài)一致。蟾蜍靈組K562細胞，細胞懸浮性增高，透明度下降，細胞中出現(xiàn)空泡，并有膜包裹的凋亡小體。見圖1。

2.2 Heochst 33342／PI結(jié)果

對照組K562 細胞大小一致，熒光均勻，熒光相對較淡。蟾蜍靈各處理組K562細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細胞體積變小，胞漿濃縮、核固縮、核裂解、凝集染色質(zhì)熒光強度增強，并有膜包裹的凋亡小體形成。見圖2。計算各處理的凋亡率，結(jié)果顯示，0.10、1.00和10.00μmol／L蟾蜍靈作用K562細胞24h，細胞的凋亡率分別為17.68%、62.74%和88.97%。隨著濃度的升高，凋亡率升高，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，各組間差異顯著（P＜0.01）。可見蟾蜍靈可在較短時間內(nèi)引起K562細胞明顯凋亡。

2.3 電子透射顯微鏡觀察結(jié)果

對照組K562細胞形態(tài)比較規(guī)則，胞漿內(nèi)線粒體豐富，分布無規(guī)律，排列紊亂；核圓形或橢圓形，核膜清楚，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，電子密度一致。1.00μmol／L的蟾蜍靈處理K562細胞24h，細胞體積縮小，胞核胞漿比減小，胞膜尚完整，核染色質(zhì)已聚集在核膜下，呈現(xiàn)典型的新月形核凋亡細胞，其余核區(qū)電子密度較低。見圖3。

圖1 加藥前后光鏡下K562細胞形態(tài)學(xué)改變（×100）

圖2 加藥前后熒光顯微鏡下K562細胞形態(tài)學(xué)改變（×200）

圖3 加藥前后電子顯微鏡下K562細胞形態(tài)學(xué)改變（×4500）

2.4 蟾蜍靈抑制K562細胞生長結(jié)果

蟾蜍靈可抑制白血病K562細胞的生長，與對照組相比，各濃度組均能顯著抑制白血病K562細胞的生長（P＜0.01）。蟾蜍靈對K562 細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）約為0.013μmol／L，且蟾蜍靈的生長抑制作用呈時間劑量依賴性，各組間兩兩比較差異顯著（P＜0.01）。實驗結(jié)果顯示，在0.001～1.000μmol／L蟾蜍靈均能抑制K562細胞生長。見表1。

表1 蟾蜍靈對K562細胞的生長抑制作用（，n＝6）

2.5 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

0.10、1.00μmol／L和10.00μmol／L 蟾蜍靈作用K562細胞24h，結(jié)果顯示對照組沒有出現(xiàn)梯狀帶，1.00μmol／L和10.00μmol／L 組出現(xiàn)典型的梯狀帶。見圖4。

2.6 細胞周期分析結(jié)果

0.10μmol／L蟾蜍靈作用12h可將K562細胞周期阻滯在G2／M 期，作用24h，K562 細胞G2／M期數(shù)量并未明顯增加，但凋亡細胞數(shù)增加至14.9%，凋亡細胞數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)典型的亞G1峰。見表2、圖5。

圖4 蟾蜍靈作用下，K562細胞DNA 在電泳上形成梯狀帶

表2 0.10μmol／L蟾蜍靈對K562細胞周期分布及凋亡的影響（%）

圖5 K562細胞的流式細胞圖

3 討論

實驗采用MTT 法進行藥敏試驗判定蟾蜍靈在體外對人髓性白血病K562細胞是否確切有抗增殖作用。結(jié)果表明，蟾蜍靈在0.001μmol／L 即可明顯地抑制人髓性白血病K562細胞的生長（P＜0.01），增加蟾蜍靈濃度抑制作用更加明顯（P＜0.01）。由此可以得出，人髓性白血病K562細胞對蟾蜍靈敏感性良好。與以前的報道［4－5］相一致，即蟾蜍靈以時間劑量依賴形式抑制急性早幼粒性白血病NB4細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，能夠抑制人單核細胞白血病細胞TPH－1細胞生長并誘導(dǎo)其分化。

已有研究［6－7］表明，蟾蜍靈能夠引起HL60細胞和U937細胞凋亡。我們研究說明，蟾蜍靈可誘導(dǎo)人K562細胞凋亡，且呈時間和劑量依賴關(guān)系。用1.00μmol／L蟾蜍靈作用K562細胞24h，在倒置光相差顯微鏡下觀察到細胞中出現(xiàn)小泡，隨即降解消失；熒光雙染顯示染色質(zhì)凝集、斷裂、凋亡小體形成。透射電鏡結(jié)果顯示，細胞體積縮小，胞核胞漿比減小，胞膜尚完整，核染色質(zhì)已聚集在核膜下，呈現(xiàn)典型的新月形核凋亡細胞，其余核區(qū)電子密度較低。由蟾蜍靈處理的細胞中提取的DNA 瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，出現(xiàn)典型核酸斷裂的梯狀帶，被認為是程序性細胞死亡的早期事件，表明蟾蜍靈能以劑量和時間依賴關(guān)系誘導(dǎo)人白血病K562凋亡。此結(jié)論與以前的報道［7］相一致。盡管蟾蜍靈能夠誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡，但即使在較高濃度（10－6mol／L）下，也未能觀察到蟾蜍靈誘導(dǎo)人正常血液中單核細胞和多形核細胞凋亡。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)，0.10μmol／L 蟾蜍靈可明顯阻滯K562細胞于G2／M 期，該效應(yīng)呈明顯的時間依賴關(guān)系。此外，K562細胞的G2／M 期阻滯在12h內(nèi)就很明顯，而此時無論是熒光染色還是流式細胞術(shù)檢測，都僅有少量細胞發(fā)生凋亡。隨著時間延長，才能檢測到明顯的細胞凋亡。而細胞周期的阻滯作用無明顯升高，說明細胞周期的阻滯抑制了細胞生長，最終引起細胞凋亡。

蟾蜍靈最可能的膜受體為Na＋－K＋ATP酶，因為在各種腫瘤細胞的細胞膜上，該酶的活性可被蟾蜍靈抑制。蟾蜍靈對人腫瘤細胞的特異作用可歸因于人細胞膜上Na＋－K＋ATP 酶［8］的特異結(jié)構(gòu)?？沟蛲龌騭urvivin［9］表達檢測有望進一步闡述蟾蜍靈抑制白血病細胞生長的分子機制。

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