麥勤勤，陳寅生，程麗紅，邵麗麗，吳花粉，孫明麗，武小紅

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）為多孔菌科的藥用真菌，分布于北半球45°～50°的地區(qū)。在我國的黑龍江、吉林兩省資源較為豐富，民間用于治療一些惡性腫瘤［1］。藥理實驗［2－4］表明，樺褐孔菌能抑制HTC和ZHC肝癌細(xì)胞、瓦克癌肉瘤W256細(xì)胞、人MCF－7乳腺癌細(xì)胞、白血病P388細(xì)胞等多種癌細(xì)胞的生長，同時樺褐孔菌還具有抗病毒、抗炎及保肝等廣泛生物活性。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［5］發(fā)現(xiàn)，其主要有效成分為四環(huán)三萜類化合物，并有報道［6］對其中三萜進行生物轉(zhuǎn)化的研究。

樺褐孔菌中羊毛脂烷型三萜類化合物大多數(shù)具有同一結(jié)構(gòu)的母核，即羊毛甾母核，相同的母核決定了它們具有許多的相同之處，而不同的取代基又使它們呈現(xiàn)出不同的性質(zhì)。我們的實驗對樺褐孔菌中的羊毛脂烷型三萜系列化合物進行了分離制備，并總結(jié)了其色譜行為、理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)等諸方面的一些規(guī)律。

1 儀器與試劑

AVANCE 400M型核磁共振儀（1H－NMR：300 MHz，13C－NMR：75 MHz，德國Bruker公司）；Esquire LC質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；XT6顯微熔點測定儀（北京市科技電光儀器廠）；Agilent 1260型HPLC儀（美國Agilent公司）；半制備HPLC 色譜柱為Sinochrom ODS－BP （10 mm ×250 mm，10μm），（大連依利特分析儀器廠）；色譜甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；Sephadex LH－20（Pharmacia公司）；Rp－18柱層析材料、Rp－18高效薄層預(yù)制板（Merck公司）；柱色譜用硅膠300～400目、薄層層析用硅膠GF254（青島海洋化工廠）；實驗所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 提取及分離

取樺褐孔菌干燥子實體粉末1000g，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，減壓回收溶劑后得乙醇提取物56g。用水將乙醇提取物均勻分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取用溶劑與水層體積比均為1∶1，各萃取4次，分別得到石油醚萃取物2.3g、乙酸乙酯萃取物26.8g、正丁醇萃取物17.0g和水層殘留物8.7g。取乙酸乙酯萃取物10g，進行硅膠柱層析，用石油醚－乙酸乙酯（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到化合物1（37mg）和7個餾分Fr.1～Fr.7。將其中Fr.1餾分進行硅膠柱層析，用石油醚－乙酸乙酯（10∶1→3∶1）梯度洗脫，得到化合物2（134mg）和5個餾分Fr.1－1～Fr.1－5。將其中Fr.1－2餾分進行ODS開放柱層析，用甲醇－水（85%→100%）梯度洗脫，得到化合物3（56 mg）。將Fr.3餾分進行硅膠柱層析，用氯仿－丙酮（30∶1→8∶1）梯度洗脫，得到5個餾分Fr.3－1～Fr.3－5，繼而將Fr.3－4進行半制備HPLC，甲醇－水（82∶18）洗脫，在保留時間41.9min和46.5min處分別得到化合物4（23mg）和化合物5（16mg）。將Fr.4餾分進行硅膠柱層析，用氯仿－甲醇（15∶1→8∶1）梯度洗脫，得到化合物6（106mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1

白色針晶（MeOH），熔點137.2～137.8℃。1H－NMR（CDCl3）：在高場區(qū)可見δ0.70（3H，s），0.82（3H，s），0.89（3H，s），0.99（3H，s），1.01（3H，s）5個角甲基的尖峰，這是四環(huán)三萜類化合物的典型特征；0.93（3H，d，J＝6.4Hz）為21－CH3峰，被20－ 位質(zhì)子偶合而裂分為雙峰，1.62（3H，s）和1.70（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個烯丙位的甲基峰。另外可見3.26（1H，dd，J＝4.8，11.6Hz，H－3），5.11（1H，t，J＝1.2，6.4Hz）則是24位雙鍵上的質(zhì)子信 號。13C－NMR（CDCl3）：δ79.007為C－3 信 號，134.38、134.38、130.97、125.25存在4個烯碳信號，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道的羊毛甾醇對照一致。故鑒定化合物1為羊毛甾醇。

3.2 化合物2

白色針晶（MeOH），熔點182.1～182.9℃。1HNMR（CDCl3）：在高場區(qū)可見δ0.69（3H，s），0.71（3H，s），0.84（3H，s），0.95（3H，s），0.96（3H，s）5個角甲基的尖峰；0.91（3H，d，J＝6.6Hz）為21－CH3峰，1.62（3H，brs）和1.71（3H，brs）為26－CH3和27－CH3兩個烯丙位的甲基峰，因發(fā)生烯丙偶合而使峰展寬。另外可見3.19（1H，dd，J＝4.6，6.8Hz，H－3），3.63（1H，m，H－21），5.16（1H，t，J＝6.8，7.0 Hz，H－24）。13C－NMR（CDCl3）：δ78.83為C－3信號，73.44為側(cè)鏈上與－OH相連的C－21信號，134.87、134.51、134.11、121.36存在4個烯碳信號，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道的inotodiol對照一致。故鑒定化合物2為inotodiol。

3.3 化合物3

白色針晶（MeOH），熔點145～146℃。1H－NMR（CDCl3）：在高場區(qū)可見δ0.69（3H，s），0.81（3H，s），0.91（3H，s），0.97（3H，s），1.00（3H，s）5個角甲基的尖峰；1.57（3H，s）和1.68（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個烯丙位的甲基峰。5.06（1H，t，J＝7.1Hz）是24位雙鍵上的質(zhì)子信號，9.47（1H，d，J＝5.7Hz）則是20位上的質(zhì)子信號。13C－NMR（CDCl3）：δ78.96為C－3信號，134.72、133.93、132.46、123.54存在4個烯碳信號，206.29為與C－20相連的－CHO 上的碳信號，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報道的3β－h(huán)ydroxy－lanosta－8，24－diene－21－al對照一致。故鑒定化合物3為3β－h(huán)ydroxy－lanosta－8，24－diene－21－al。

3.4 化合物4

白色針晶（MeOH），熔點290～292℃。1H－NMR（CDCl3／CD3OD，2∶1）：在高場區(qū)可見δ0.46，（3H，s），0.53（3H，s），0.61（3H，s），0.72（3H，s），0.72（3H，s）5個角甲基的尖峰；0.61（3H，d，J＝5.4Hz）為21－CH3峰，0.93（3H，s）和0.95（3H，s）為26－CH3和27－CH3的甲基峰，另外可見2.92（1H，t，J＝7.6，8.5 Hz，H－3），3.58（1H，m，H－24），4.00（1H，m，H－22）。13C－NMR（CDCl3／CD3OD，2∶1）：δ78.12為C－3信號，134.21、133.74兩個烯碳信號，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道的inonotsuoxide A 對照一致。故鑒定化合物4為inonotsuoxide A。

3.5 化合物5

白色針晶（MeOH），熔點240～242℃。1H－NMR（CDCl3／CD3OD，1∶2）：在高場區(qū)可見δ0.73（3H，s），0.78（3H，s），0.87（3H，s），0.96（3H，s），0.98（3H，s）5個角甲基的尖峰；0.92（3H，d，J＝8.4Hz）為21－CH3峰，1.20（3H，s）和1.13（3H，s）為26－CH3和27－CH3的甲基峰。另外可見3.97（1H，m，H－24），4.00（1H，m，H－22）。13C－NMR（CDCl3／CD3OD，1∶2）：δ77.57為C－3 信號，133.35、133.96 兩個烯碳信號，其13C－NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道的inonotsuoxide B 對照一致。故鑒定化合物5為inonotsuoxide B。

3.6 化合物6

白色針晶（MeOH），熔點244.8～246.7℃。1HNMR（DMSO）：在高場區(qū)可見δ0.68（3H，s），0.69（3H，s），0.88（3H，s），0.90（3H，s），0.91（3H，s）5個角甲基的尖峰，是四環(huán)三萜類化合物的典型特征；1.53（3H，s）和1.63（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個烯丙位的甲基峰。5.07（1H，t，J＝7.2，7.0Hz）是24位雙鍵上的質(zhì)子信號，12.07 則是20位的質(zhì)子信號。13C－NMR（DMSO）：δ77.20為C－3 信號，134.72、133.80、131.61、124.28存在4個烯碳信號，177.52為與C－20相連的 －COOH 上的碳信號，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報道的trametenolic acid對照一致。故鑒定化合物6為trametenolic acid。

4 化合物結(jié)構(gòu)及性質(zhì)分析

4.1 光譜性質(zhì)

化合物1～6母核（見圖1）相同，只是17－ 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同。由于分子中均不存在共軛系統(tǒng)，故側(cè)鏈上發(fā)生取代基變化時，均通過誘導(dǎo)效應(yīng)影響其相鄰的2～3個碳的化學(xué)位移。如化合物2與化合物1 比較，發(fā)生22－OH 取代后，17、20、21、23、24、25－ 位化學(xué)位移均發(fā)生相應(yīng)變化（見表1），其他化合物亦然。每一個有機化合物分子內(nèi)部都是一個有機的整體，任何位置發(fā)生取代基的變化，都會使整個分子中的電子云密度發(fā)生變化，只是變化顯著者才有明顯的化學(xué)位移的變化。由表1可以看出，雖然化合物1～6的結(jié)構(gòu)母核完全相同，但1～17位碳化學(xué)位移卻不盡相同，因為化合物1～6結(jié)構(gòu)中取代基不盡相同，整體分子中的電子云密度也不相同，故表現(xiàn)為相同結(jié)構(gòu)母核上的碳化學(xué)位移略有差異?；衔?和5互為構(gòu)型異構(gòu)體，它們除了在22、25、26、27－ 位碳處表現(xiàn)出較小的差異之外，其他位置均一致。故實驗對其進行了HNMR、CNMR、HSQC、HMBC、DEPT、NOESY 等全面的核磁共振譜測定，以準(zhǔn)確歸屬其C和H。

4.2 色譜行為

在硅膠色譜（正相色譜）中，化合物的極性越大，越易被固定相吸附，Rf越小，而基團的極性大小順序為羧基＞醛基＞羥基，故表2中化合物1～6的Rf值依次減小，化合物4和5由于極性相近而難以分離。

4.3 顏色反應(yīng)

由表2可以看出，化合物1～6顯色后所呈現(xiàn)的顏色均為紅色系，這也是三萜區(qū)別于甾體類化合物的顯著特征之一。由于此類顏色反應(yīng)過程主要是使羥基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵移位、雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙烯系統(tǒng)，又在酸作用下形成陽碳離子而呈色，故化合物1～6中羥基較多者形成的共軛鏈就長，呈色也就越深，如化合物4和5。同理，結(jié)構(gòu)中原有的不飽和鍵越多，呈色也越深，如化合物3和6，其中，化合物6的顏色最深，推測是因為其結(jié)構(gòu)中含有的強極性基團羧基，對pH的影響更敏感，故在硫酸作用下更易呈色。

4.4 熔點

由于在碳原子數(shù)目相同的情況下，分子中的極性基團越多，則分子間作用力越大，熔點也越高，反之亦然。表2中化合物1的熔點最低，因為它只有一個羥基，而其他化合物的羥基數(shù)目多于1。其次，由于羥基中的活潑氫能與另一分子中的電負(fù)性原子O 形成氫鍵，而使熔點升高，故表2中化合物2的熔點高于化合物3，因為化合物3中少了一個羥基，而其醛基中雖有電負(fù)性原子O，但缺乏活潑氫，故形成氫鍵的能力降低。此外，分子的立體結(jié)構(gòu)即分子的形狀會影響其在固體晶格中排列的緊密程度，進而影響其熔點的高低，故表2中化合物4和5雖然所含極性基團的類型及數(shù)目均相同，但是由于它們的立體結(jié)構(gòu)不同（為構(gòu)型異構(gòu)體），故熔點有差別。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)母核

表1 化合物1～6的13C－NMR數(shù)據(jù)（100 MHz）

表2 化合物1～6的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

5 首次報道化合物4、5的DEPT和HSQC譜

化合物4和5在文獻(xiàn)［10］中被首次報道，并通過理化性質(zhì)及IR、UV、NMR、MS等將其鑒定為inonotsuoxide A和inonotsuoxide B。我們在實驗中補充測定了其DEPT和HSQC 譜，通過DEPT和HSQC的結(jié)合，更準(zhǔn)確地歸屬每一個碳；此外，HSQC 協(xié)助解決了一些難以辨認(rèn)的峰的歸屬。

5.1 化合物4的峰

化合物4中24－C（δ77.04）峰大部分隱藏于CDCl3溶劑峰中，很難被發(fā)現(xiàn)。在HSQC 譜中可以看到77.04碳峰與3.58（m 峰）氫峰的相關(guān)峰，結(jié)合HMBC，并與已知化合物對照，最后確定δ77.04為24－C。12－C（δ30.44）與15－C（δ30.45）極其接近，難以分辨，在HSQC譜中觀察到其對應(yīng)于3個相關(guān)峰，結(jié)合HMBC，將其區(qū)分為2個非常相近的峰。21－CH3的雙峰中有一個峰完全隱藏于一個甲基尖峰中，不能發(fā)現(xiàn)，影響對化合物的結(jié)構(gòu)判斷。在HSQC譜中觀察到21－C（δ11.56）的相關(guān)峰與0.61和0.62氫峰對應(yīng)，而此2個氫峰為6個H，后又觀察到27－C（δ20.36）與0.61氫峰相關(guān)，再結(jié)合HMBC，并與已知化合物對照，最后確定21－CH3的雙峰有一個峰完全隱藏于27－CH3的單峰里。

5.2 化合物5的峰

化合物5中17－C（δ47.18）完全隱藏于CD3OD溶劑峰中，不能發(fā)現(xiàn)，會讓我們少計算一個C。但在HSQC譜中，觀察到δ47.18碳峰與δ1.42氫峰的相關(guān)峰，且在DEPT中能看到向下的δ47.18 碳峰，故判斷CD3OD 溶劑峰中隱藏了一個δ47.18 碳峰。2－C與16－C的信號重疊（δ26.38），也可能在HSQC中發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)于不同H 峰而得到辨認(rèn)。

我們的實驗共分離得到了6個四環(huán)三萜類化合物，并在實踐基礎(chǔ)上對其理化性質(zhì)、色譜行為和光譜性質(zhì)進行了分析和總結(jié)。實驗所分離的化合物為具有羊毛甾母核的同系物，為研究其生物活性成分并探討其構(gòu)效關(guān)系，奠定了堅實的基礎(chǔ)。

［1］Kier L B.Triterpenes of Poria oblique［J］.J Pharm Sci，1960，50（6）：471－476.

［2］Xu H Y，Sun J E，Lu Z M，et al.Beneficial effects of the ethanol extract from the dry matter of a culture broth of Inonotus obliquus in submerged cultureon the antioxidant defence system and regeneration of pancreaticβ－cells in experimental diabetes in mice［J］.Nat Prod Res，2010，24（6）：542－553.

［3］Sun J E，Ao Z H，Lu Z M，et al.Antihyperglycemic and antilipidperoxidative effects of dry matter of culture broth of Inonotus obliquus in submerged culture on normal and alloxan－diabetes mice［J］.J Ethnopharmacol，2008，118（1）：7－13.

［4］Cha J Y，Jun B S，Yoo K S，et al.Fermented chaga mushroom （Inonotus obliquus）effects on hypolipidemia and hepatoprotection in Otsuka Long－Evans Tokushima fatty（OLETF）rats［J］.Food Sci Biotechnol，2006，15（1）：122－127.

［5］Nomura M，Takahashi T，Uesugi A，et al.Inotodiol，a lanostane triterpenoid，from Inonotus obliquus inhibits cell proliferation through caspase－3－dependent apoptosis［J］.Anticancer Res，2008，28（5A）：2691－2696.

［6］趙芬琴，陳寅生，許彩紅，等.4種三萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化探討［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，30（3）：177－181.

［7］孔令義，閔知大.大戟根化學(xué)成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1996，31（7）：524－529.

［8］Shin Y，Tamai Y，Terazawa M.Chemical constitents of Inonotus obliquus（Pers.：Fr.）Pil.（Aphyllophoromycetideae）III：a new triterpene，3β，22，25－trihydroxy－lanosta－8－ene from sclerotia［J］.Int J Med Mushrooms，2000，2（3）：322－329.

［9］Kahlos K，Hiltunen R，V Schantz M.3β－Hydroxy－lanosta－8，24－dien－21－al，a New Triterpene from Inonotus obliquus［J］.Planta Med，1984，50（2）：197－198.

［10］Nakata T，Yamada T，Taji S，et al.Structure determination of Inonotsuoxides A and B and in vivo anti－tumor promoting activity of inotodiol from the Sclerotia of Inonotus obliquus［J］.Bioorg Med Chem，2007，15（1）：257－264.

［11］趙芬琴，樸惠善.樺褐孔菌的化學(xué)成分研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（7）：1178－1181.